大豆不同生育期根際土壤細菌群落結構的變化

劉欣 李志英 劉瑞瑞 李璐璐 王衛(wèi)衛(wèi)

摘 要：為了解大豆根際細菌群落結構多樣性及根際細菌群落結構的變化，該研究以大豆苗期和成熟期的根際土壤為材料，采用Illumina高通量測序技術測定細菌16S rRNA V3+V4區(qū)序列，探究大豆不同生育期根際土壤細菌群落結構的變化。對原始數據進行拼接、過濾、去除嵌合體序列和聚類分析等數據處理，并對OTU進行分類學注釋。在此基礎上運用ANOVA分析物種組成變化，Alpha多樣性指數研究細菌多樣性變化。結果表明：細菌豐富度和多樣性在不同生育期有顯著變化，其中成熟期土壤中的細菌豐富度和多樣性指數均明顯高于苗期;變形菌、放線菌、酸桿菌是大豆根際的優(yōu)勢菌門，其含量在不同生育期也有顯著變化;假諾卡氏菌屬、糖絲菌屬、鞘氨醇單胞菌屬是大豆根際的優(yōu)勢菌屬，這些菌屬中的部分菌群屬于根際促生菌，具有潛在的促生效應。這些結果證實大豆的生育期對根際土壤細菌群落結構有重要影響。

關鍵詞：生育期，大豆，根際土壤，細菌群落，Illumina 高通量測序

中圖分類號：Q948.15

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）10-1363-08

Abstract：Soybean rhizosphere soils at seedling and mature stages were collected in this experiment as the research material，and Illumina high-throughput sequencing technology was used to determine the 16S rDNA V3+V4 region sequence of bacteria，in order to understand the diversity of bacterial community structure and the changes of bacterial community structure in soybean rhizosphere.

The original Tags data were used by splicing，filtering，removal of chimeric sequences and cluster analysis of data processing，OTU taxonomic annotation. On this basis，the changes of species composition were analyzed by ANOVA method，and the diversity of bacterial composition was also studied by alpha diversity index. The results showed that there was a significant change in the abundance and diversity of bacteria at different growth stages. Diversity index analysis showed that the abundance and diversity at mature stage was significantly higher than seedling stage in soybean rhizosphere soil. Species composition analysis results showed that Proteobacteria，Actinobacteria and Acidobacteria are the dominant rhizosphere bacteria at phylum level and their contents in different growth stages also significantly increased. ANOVA analysis showed that the abundances of Proteobacteria and Acidobacteria were significantly different，but Actinobacteria was not significantly different at different growth stages. Pseudonocardia，Saccharomyces and Sphingomonas were the dominant genra in the rhizosphere of soybean. Some of these genera belonged to plant growth-promoting rhizobcteria and had the potential capacity for promoting growth. These results confirm that the growth period of soybean has an important influence on the bacterial community structure in rhizosphere soil.

Key words：growth stage，soybean，rhizosphere soil，bacterial flora，Illumina high-throughput sequencing

大豆是一種重要的農作物，在世界范圍內都有廣泛的種植。它在很多領域（食品、畜禽養(yǎng)殖飼料等）都有廣泛的應用，是我國的主要糧食和重要的油料作物（Susser & Uzzell，1991;李亮等，2016;陳允正等，2011）。大豆是我國的傳統(tǒng)作物，其種植面積位于水稻、小麥、玉米之后，占我國糧食播種面積的8%～10%（蔣秋林，2010）。目前我國對大豆的需求量大幅上升，自給率持續(xù)走低，主要依靠進口大豆來維持需求（畢影東等，2014;張振華和劉志民，2009）。因此，越來越多人開始研究如何提高大豆產量，以供應國內大豆的需求。

根際土壤是指處于植物根際周圍受根系生長直接影響的土壤，根際微生物是受植物影響最大的土壤微生物群體，與植物的生長發(fā)育關系密切（陳文新等，2003）。根際微生物群落結構的變化對土壤中物質和能量的循環(huán)、有機質的分解與合成等方面有重要影響（Preston et al，2002;徐文靜等，2014）。影響根際微生物群落結構變化因素有很多，不同植物間、同一植物的不同基因型，甚至同一植物的不同生育期其根際微生物的數量、種類都有很大差別（Marschner et al，2001）。根際分泌物為根際微生物的生長提供營養(yǎng)和能源物質，其對微生物的數量、種類、分布及微生物的生長都有一定的影響（張淑香和高子勤，2000）。植物生長又與根際微生物息息相關，根際微生物的生理活動對土壤性狀、植物養(yǎng)分吸收、植物的生長發(fā)育都有明顯的影響;根際微生物的種群與植株的健康狀況有關，很大程度上決定作物的產量與品質（胡小加，1999）。有些根際微生物可以產生激素類物質促進土壤有機質分解、誘導植株增加抗性等，或者通過爭奪營養(yǎng)和占領生態(tài)位等方式抑制病原菌的生長來間接促進植物的生長（周文杰等，2016）。根際微生物群落結構失調可能會導致病原菌數量的增加，從而使作物減產。目前，有關于大豆與根際微生物相互作用的研究大多集中于大豆根際與根瘤菌和叢枝菌根真菌的共生關系（Jie et al，2013; Denison & Kiers，2011）。然而，根際土壤微生物種類繁多，各種微生物的相互作用可能影響大豆與根瘤菌和叢枝菌根真菌的相互作用。大豆在生長過程中與根際微生物相互作用的機制仍不明確。Xu et al（2009）利用DGGE研究大豆根際微生物表明，放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門的相對豐度隨著大豆生育期的變化而變化。因此，了解不同生育期大豆根際細菌群落結構的變化，對評價生育期對土壤微生物多樣性的影響具有重要意義。

一直以來由于大多數微生物在營養(yǎng)培養(yǎng)基中可培養(yǎng)性低或不能被培養(yǎng)的缺陷嚴重制約了微生物多樣性的研究（Kamagata & Tamaki，2005）。隨著分子生態(tài)學研究技術的發(fā)展，以DNA為基礎的分子分析技術，如PCR-RFLP、DGGE/TGGE、SSCPP等可以克服傳統(tǒng)培養(yǎng)技術的限制，從分子水平來直接分析微生物群落結構的變化，但這些技術存在檢測限低，工作量大，靈敏度低等缺陷（You et al，2014）。相對于以上研究手段，高通量測序技術具有速度快，耗時少，成本低廉，準確度高等優(yōu)點，能更真實地反應環(huán)境中群落的特點。目前，高通量測序技術主要是Illumina、Roche454 和Life Technologies 等公司開發(fā)的測序平臺（樓駿等，2014）。Illumina HiSeq 2500 在一個運行周期7 d的時間里可以產出600 G的數據量，具有數據通量高，準確率高，成本可控等優(yōu)點（Quail et al，2012）。

本研究以大豆為材料，采集大豆苗期和成熟期的根際土樣。運用Illumina測序平臺對土壤樣品16S rDNA進行了高通量測序技術，探究兩個不同生育期的大豆根際土壤細菌群落結構多樣性及變化，這對評價生育期對土壤微生物多樣性的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

所用土壤樣本采集于陜西省咸陽市（107°38′ E，34°11′ N，暖溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫13.4 ℃，降水量519.2 mm，日照時數2 175 h）大豆大田。采用“S形采樣法”在大豆田中選擇5個采樣點，按照Riley & Barber（1969）的抖落法，用無菌小刷子刷取粘著于植物根上的土壤，5個植株的土壤合為一個樣本，最終將采集完成的樣本過2.0 mm篩，混合均勻分為3份，放置于-20 ℃冰箱中保存。樣品采自苗期（2016年6月24日），樣品編號為DWA;成熟期（2016年9月30日），樣品編號為DYA，共6個樣本（2個時期，3個重復）。

1.2 土壤總DNA的提取與電泳檢測

使用PowerSoilDNA Isolation Kit（MoBio，美國）提取土壤總DNA，經瓊脂糖凝膠電泳定性檢測后，再采用核酸定量分光光度計（NanoDrop，美國）測定濃度后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16S rRNA V3+V4區(qū)的 PCR 擴增及測序

以提取的總DNA作為模板，以338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）為引物（Zhang et al，2015），對細菌的16S rRNA V3+V4區(qū)進行擴增。PCR反應體系共50 μL：基因組DNA 40-60 ng，*Vn F（10 μmol·L-1） 1.5 μL，*Vn R（10 μmol·L-1） 1.5 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL，High GC Enhancer 10 μL，Bμffer 10 μL，dNTP 1 μL，ddH2O 補至總體系50 μL。反應程序為95 ℃預變性5 min，進行15次循環(huán)（95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min），72 ℃最終延伸7 min。對PCR產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，對建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500平臺進行測序，PCR 擴增及測序工作由北京百邁客公司完成。

1.4 數據分析

測序完成后，使用FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品的測序片段進行拼接，得到的拼接序列即原始數據;使用 Trimmomatic v0.33軟件，對原始數據進行過濾，得到高質量的過濾后數據;使用 Uchime v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據。使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的 Uclust對序列按 97%的相似度水平下進行聚類，獲得樣品的OTU分類數據，并基于Silva（細菌）分類學數據庫對OTU進行分類注釋。

2 結果與分析

2.1 樣品序列數特點

對各樣本細菌的16S rRNA V3+V4區(qū)測序，經數據前處理，最終得到的測序長度集中在 280～460 bp之間，且2個樣品共產生1 919個OTU。各樣本統(tǒng)計結果見表1。從樣本中隨機抽取一定數量的序列，統(tǒng)計這些序列所代表的物種數目，并以序列數與物種數來繪制稀釋性曲線，如圖1示。隨著測序條數的增加，曲線逐漸趨于平緩，說明測序深度已經足夠。

2.2物種組成分析

物種組成分析反映樣品在不同分類學水平上的群落結構。圖2：a和圖2：b分別展示門（phylum）水平和屬（genus）水平的群落結構和分類比較結果，相對含量前十的菌門是放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、浮霉菌門（Planctomycetes）、裝甲菌門（Armatimonadetes）。在屬水平，優(yōu)勢屬主要有變形菌門的Sphingomonas、H16、Phaselicystis、haliangium，酸桿菌門的RB41、Bryobacter，放線菌門的Pseudonocardia、Saccharothrix、Nocardioides，還有相對豐度較高的未分類菌屬。不同生育期的土樣中細菌的菌群分布有差異，其中在樣品DYA中變形菌門、芽單胞菌門的豐度有所下降，其他菌門的豐度都有不同比例的上升。從屬水平上，相較于DWA，樣品DYA中Sphingomonas、Pseudonocardia的豐度有明顯的下降，而RB41的含量明顯上升。

分別對樣品在門分類水平和屬分類水平進行ANOVA分析，發(fā)現(xiàn)在門水平上豐度排名前十的門中除放線菌門，浮霉菌門，裝甲菌門外，其他菌門都存在顯著差異，其中變形菌門的差異極顯著（P=0.000 81）;在屬分類水平上，差異顯著的屬注釋到Pseudonocardia（P=0.000 839）、Phaselicystis（P=0.000 144）、Saccharothrix（P=0.000 404）、RB41（P=0.001 633）、Nocardioides （P=0.011 744），其中差異最為顯著的屬為Phaselicystis。

2.3 細菌群落多樣性分析

兩個樣品的Alpha多樣性指數，包括Shannon、Simpson、Ace、Chao1 4個指數如表4所示。表4結果顯示，Shannon DYA>DWA，Simpson DYA2.4 NMDS分析結果

NMDS（nonmetric multidimensional scaling）分析，即非線性多維標度分析，常用于比對樣本組之間的差異。對所有樣品進行NMDS分析，如圖3所示，樣品點的分布代表樣品間相似的程度，從圖中可以看出樣品DYA與DWA明顯位于不同的象限內，說明兩個樣品間相似度不高。

3 討論與結論

細菌是土壤微生物中的重要組成部分，其種類、數量對土壤的生物化學性質及土壤養(yǎng)分有直接影響。Illumina高通量測序技術具有快速、方便、準確性高等特性，而廣泛應用于土壤微生物多樣性的研究。本研究通過此方法分析大豆兩個不同生育期根際土壤中細菌的群落結構及多樣性。經該方法得到的結果顯示各個樣本的覆蓋率均在99%以上，證明本次測序結果能夠反應樣本的真實情況。

本研究發(fā)現(xiàn)，所有樣品中共含有25個細菌門。其中變形菌、酸桿菌、放線菌3大門類的相對豐度最高。袁紅朝等（2015）分析了稻田土壤細菌的群落結構，發(fā)現(xiàn)變形菌、酸桿菌和綠彎菌是稻田土壤優(yōu)勢細菌，其次是放線菌。Jangid et al（2008）研究發(fā)現(xiàn)變形菌在不同類型的耕作土壤中都是絕對優(yōu)勢菌屬，其次是酸桿菌。楊菁等（2015）對降香黃檀不同混交林土壤細菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)，土壤中主要菌群有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門。牛世全等（2017）分析了河西走廊地區(qū)鹽堿土壤群落結構，發(fā)現(xiàn)變形菌門含量最高，占28.56%;其次是放線菌門，占17.2%;擬桿菌門占12.3%。本研究發(fā)現(xiàn)，在大豆根際土壤中變形菌門的含量最高，其次是酸桿菌門，放線菌門，而綠彎菌門的含量較少，這可能于地理因素引起的生態(tài)多樣性、土壤營養(yǎng)情況和作物種類有關。本研究中，相對豐度較高的菌屬有：Sphingomonas、H16、Phaselicystis、Haliangium、RB41、Bryobacter、Pseudonocardia、Saccharothrix、Nocardioides。假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）屬于放線菌門，該屬微生物在產生抗生素和維生素降解方面有重要作用（Carr et al，2012; Cuesta et al，2013），此外還發(fā)現(xiàn)該屬的某些菌株還能產生維生素、酶類等重要的生物活性物質（呂志堂和劉志恒，1999）。糖絲菌屬（Saccharothrix）屬于放線菌門，該屬的微生物在纖維素降解和生物防治方面有重要的作用，王麗娟等（2007）研究表明橘色糖絲菌對大豆種傳病原真菌有良好的防治效果。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）屬于變形菌門，該屬微生物在降解復雜有機物方面有重要的作用（胡杰等，2007），另外還發(fā)現(xiàn)該屬的某些微生物能分泌吲哚-3-乙酸促進植物生長（Tsavkelova et al，2007），但該屬也包括一些致病菌，如鞘氨醇單枯病（Buonaurio et al，2002）。我們發(fā)現(xiàn)大豆根際菌群的豐度在不同生育期有一定的變化。這可能是由于大豆在生長過程中根際分泌物發(fā)生了變化，有報道稱在擬南芥的生長過程中根際微生物的變化與根際分泌物有關（Chaparro et al，2013）。

Alpha多樣性可以反映單個樣品內部的物種多樣性，Chao1和Ace指數簡單地反映出群落中物種的數量，而不表示群落中每個物種的豐度信息。Shannon和Simpson指數用于衡量群落多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，Chao1、Ace、Shannon指數值越大，Simpson指數值越小說明樣品的物種多樣性越高。本研究結果表明：Chao1和Ace指數顯示DWA>DYA，Shannon指數顯示DWADYA，Chao1 指數在所有樣品間的趨勢與加入了均勻度影響的Simpson指數不同。Haegeman et al（2013）指出，Chao1指數在計算時加入了低豐度序列，會引起多樣性的低估，且這種低估會隨菌群物種數的增加而加大，這可能是本研究中采用不同多樣性指數得到不一致結果的主要原因。NMDS即非度量多維標定法，用于比較樣本的組內或組間差異。NMDS是非線性模型，能更好的反應樣本間的差異，其效果優(yōu)于PCA/PCoA等線性模型。本研究中Stress=0.000 0，表明NMDS分析可靠性高。結果顯示樣品DWA與DYA明顯位于不同的象限內，說明兩個樣本間相似性不高，即生育期不同根際細菌的群落結構有一定的差異。有大量研究證實根際微生物的數量和群落結構會隨生育期的不同而發(fā)生改變。Duineveld et al（2001）對菊花根際微生物研究發(fā)現(xiàn)，幼齡植株與成熟植株根際土壤微生物群落結構差異較大。Farina et al（2011）研究發(fā)現(xiàn)，油菜根際微生物群落結構因生育期不同而不同，蓮座期的豐度最高。張健（2014）運用DGGE技術對大豆根際細菌群落結構進行研究發(fā)現(xiàn)，盛花期的細菌多樣性高于成熟期。Xu et al（2009）依據DGGE圖譜發(fā)現(xiàn)，大豆根際細菌多樣性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，從初花期開始增加，到鼓粒期達到最大，成熟期最低。本研究發(fā)現(xiàn)大豆生育后期的微生物多樣性高于生育前期，與張健（2014）、Xu et al（2009）結果不一樣可能與DGGE技術本身的缺陷有關，該技術僅能分析優(yōu)勢的微生物菌群，且檢測限低，隨機性大，可能低估微生物群落大小和多樣性;另外與作物品種、土壤營養(yǎng)狀況、地理環(huán)境因子等因素相關。

本研究運用高通量測序技術探究兩個不同生育期大豆根際土壤中細菌群落結構變化。通過對大豆兩個生育期根際土壤分析可知，成熟期土壤的多樣性指數高于苗期根際土壤，這表明大豆的生育期對根際土壤細菌群落結構有重要影響。本研究為了解大豆根際細菌群落結構多樣性及根際細菌群落結構的變化提供理論依據。