親水作用—反相二維液相色譜串聯質譜法鑒定水稻蛋白質

高歡歡 馬有寧 林曉燕 柴爽爽 秦美玲 張涵彤 何巧 陳銘學

摘 要 建立了親水作用-反相二維液相色譜串聯質譜分析水稻葉片蛋白質組學的方法。利用標準肽段系統分析了液相色譜流動相酸堿度對二維親水作用-反相色譜系統正交性的影響。結果表明， 第一維親水作用色譜在堿性 （pH 9.3） 和第二維反相色譜在酸性 （pH 3.3） 的條件下，正交性最佳（R2=0.34113）。在此基礎上，結合餾分收集技術進一步評價了本測試系統在水稻葉片蛋白質分析中的正交性。結果表明，在所有餾分收集組分中，鑒定次數小于2次的水稻葉片肽段占總肽段數目的50%以上，且一維液相色譜餾分收集的肽段在第二維色譜及質譜分離分析中，可以較好地分布在不同時間段的洗脫窗口，表明本研究建立的親水作用-反相二維液相色譜串聯質譜結合餾分收集技術在復雜水稻葉片蛋白質分離鑒定中可提供良好的的分離正交性。結合水稻蛋白質數據庫檢索，共鑒定出207345個肽段，歸屬于2930個蛋白質簇。

關鍵詞 親水作用-反相二維液相色譜； 蛋白質； 水稻葉片； 納升級液相色譜串聯質譜； 正交性

1 引 言

水稻作為重要的糧食作物，是全球超過一半以上人口生存的食物來源，深入了解水稻生長發育過程及調控具有重要意義[1]。蛋白質作為基因功能的最終表現者和生物體性狀的直接參與者，在蛋白質水平研究水稻發育生物學更具有直接性[2，3]。目前，植物蛋白質組學的分離分析主要分為雙向電泳技術 （2-DE） 和多維液相色譜技術[4，5]。雙向電泳技術是經典的蛋白質組學研究方法，但是其本身具有對分離極酸、極堿等蛋白的限制和無法與質譜直接聯用等不足，而近年出現的基于液相色譜-串聯質譜技術逐漸在蛋白質組學研究領域發揮越來越重要的作用[6，7]。多維液相色譜主要通過不同維數色譜對肽段的保留機制差異，提高分辨率及增加系統峰容量，改善復雜樣品的分離分析[8]。因此，選擇合適的色譜類型組合是建立多維液相色譜系統的關鍵。現已建立的多維液相色譜主要是二維液相色譜，如離子交換-反相色譜[9]、反相-反相色譜[10]、親水作用-反相色譜[11]等。離子交換-反相色譜 （SCX-RP） 具有良好的正交性，是最早應用于蛋白質組學研究的二維液相色譜。但是，大多數肽段所帶電荷量相似 （+1、+2、+3），導致保留能力相似，分離效率較低，此外脫鹽過程也會有蛋白損失。這些因素都使得SCX-RP在蛋白質組學分析中存在局限[9，10]。研究表明，除選擇不同的固定相外，改變流動相酸堿度也可實現二維液相色譜對肽段保留的差異，例如二維反相-反相色譜 （RP-RP） 通過色譜間急劇變化的流動相酸堿度，實現肽段電荷分布差異，進而實現肽段選擇性分離分析[12]。

由于二維反相-反相色譜均通過疏水性實現對肽段的選擇，反相-反相系統在復雜肽段分離中不能提供良好的正交性[12]。依據對肽段的不同保留機制和對復雜體系高效的分離能力而建立的親水作用-反相色譜 （HILIC-RP）為多維液相色譜分離技術開創了新的思路[13，14]。Chen等[15]采用在線親水色譜-反相色譜分析大腸桿菌溶菌酶蛋白質組學。親水作用-反相色譜已廣泛應用于人類及動物體蛋白質組學的分析，但在植物蛋白質領域應用較少，主要是由于植物體本身的次生代謝物等雜質一定程度上干擾色譜分離[16]。至今尚未見將親水作用-反相色譜應用于水稻器官或組織水平的蛋白質組分析的相關報道。

近年來，在復雜的蛋白質組學實際樣品分析中，餾分收集技術被廣泛應用于反相-反相二維液相色譜系統，提高了系統分離正交性[17，18]。首先將復雜樣品經過一維色譜預分離出多組餾分，各組餾分按照一定的組合方式 （如時間方式） 組合，再進行第二維色譜及質譜的分析。Dwivedi等[17]將餾分收集技術應用到反相-反相二維液相色譜，提高了系統正交性，蛋白質的鑒定量增加了近30%。此外，餾分收集技術的引入，解決了由低堿度肽段的信號抑制和低豐度蛋白的采樣過疏等引起的重現性降低的問題[19]。

本研究建立了親水作用-反相色譜分離-串聯高分辨質譜的方法，應用于水稻葉片蛋白質組學分析。利用特征標準肽段系統考察了各維液相色譜在不同酸堿度條件下對二維液相色譜系統分離正交性的影響。此外，由于水稻葉片中蛋白復雜，餾分收集的引入可進一步降低由質譜數據依賴模式掃描對蛋白質的覆蓋，提高鑒定重現性，為獲得更全面的水稻葉片中蛋白質種類的研究奠定了基礎，以促進蛋白質組學對水稻器官發育調控機理等方面的研究，為植物性蛋白質組學研究提供技術參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜系統用于標準肽段評價二維親水作用-反相色譜系統的正交性，包括1260高效液相色譜儀、6545 四極桿飛行時間液相色譜-質譜聯用系統 （美國Agilent公司）。水稻葉片樣品的蛋白質簇分析采用離線模式HPLC-Nano-RPLC-MS/MS系統，包括1200高效液相色譜儀、餾分收集裝置 （美國Agilent公司）； Finnigan Surveyor 液相色譜和LTQ線性離子阱質譜 （Thermo-Electron Finnigan公司）。真空冷凍干燥機 （美國Labcinco公司）； UV-2600紫外分光光度計（日本島津公司）。固相萃取小柱（美國3M公司）。

二硫蘇糖醇 （Dithiothreitol， DTT）、碘乙酰胺 （Iodoacetamide， IAA）、NH4HCO3、KCl、乙二胺四乙酸 （EDTA）、三 （羥甲基） 氨基甲烷 （Tris-HCl）、蔗糖、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽 （CHAPS）、甲酸和氨水（美國Sigma公司）； 飽和酚溶液 （pH 7.9±0.2）、牛血清蛋白 （BSA）、 BCA蛋白質定量檢測試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）； 胰蛋白酶 （Trypsin，美國Promega公司）。21種標準肽段均合成于上海強耀生物科技公司， 基本信息見表1。所用試劑均為分析純或更高純度。實驗用水為Mill-Q水處理系統 （美國Millipore公司） 純化的超純水。水稻葉片收集于自培水稻分蘗期，80℃儲存，備用。

2.2 水稻葉片蛋白的提取、酶解

蛋白質提取和酶解參照文獻[20]的方法。提?。?研磨分蘗期水稻葉片，稱取3 g 葉片粉末，加入20 mL蛋白提取緩沖液，振蕩混勻； 加入等體積飽和酚，混勻，4℃振蕩后，離心收集上層酚相； 重復2次上述步驟； 將3次收集酚相匯總，加入0.1 mol/L 乙酸銨的甲醇溶液， 20℃沉淀過夜； 4℃振蕩離心，棄上清液； 甲醇、丙酮清洗沉淀； 晾干，加入蛋白裂解液，離心，取上清液，測定蛋白濃度。酶解： 為保證二維液相色譜上樣濃度，取適量上述粗蛋白，加入適量1 mol/L DTT，于37℃振蕩； 加入適量IAA，避光放置烷基化； 加入適量50 mmol/L NH4HCO3溶液，保持尿素濃度低于2 mol/L； 按照底物與酶質量比50∶1加入胰蛋白酶，于37℃酶解過夜； 加入甲酸終止反應。酶解結束，樣品經固相萃取小柱除鹽，冷凍干燥，備用。

2.3 利用標準肽段評價二維親水作用-反相色譜系統正交性的液相及質譜采集條件

HILIC色譜條件： XBridge Amide色譜柱（250 mm × 4.6 mm， 3.5 μm）； 流動相包括3種酸堿度體系，依次為酸性體系： （A）10 mmol/L 甲酸銨 （pH 4.5），（B）10 mmol/L 甲酸銨 （乙腈-水，9∶1，V/V）； 中性體系： （A）10 mmol/L 甲酸銨 （pH 6.8），B： 10 mmol/L 甲酸銨 （乙腈-水， 9∶1， V/V）； 堿性體系： （A） 5 mmol/L NH3·H2O， （B） 5 mmol/L NH3·H2O （乙腈-水，9∶1，V/V）。流速： 0.5 mL/min，進樣體積： 5 μL。柱溫： 25℃。液相梯度洗脫程序： 0～60 min，90%～60% B； 60～80 min，60%～40% B； 80～88 min，40%～10% B； 88～103 min，10% B。

RP色譜條件為： XBridge peptide C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm， 3.5 μm）； 流動相包括2種酸堿度體系，依次為酸性體系： （A）0.1% 甲酸溶液 （pH 3.3），（B）0.1% 甲酸 （乙腈-水，9∶1，V/V）； 堿性體系： （A）5 mmol/L NH3·H2O （pH 9.3），（B）5 mmol/L NH3·H2O （乙腈-水，9∶1，V/V）。流速：0.5 mL/min，進樣體積： 5 μL。柱溫： 25℃。液相梯度洗脫如下： 0～4 min，4%～8% B； 4～106 min， 8%～30% B； 106～116 min，30%～90% B； 116～120 min，90% B； 120～135 min， 4%B。

質譜條件： 離子化模式： 正離子模式； 2 GHz，調諧范圍： m/z 100～1400； 干燥氣溫度及流速： 350℃ 和11 L/min； 鞘氣溫度及流速： 350℃ 和12 L/min； 碎裂電壓： 135 V； 錐孔電壓： 45 V； 采集質量范圍： m/z 100～1400。內標參比離子： 嘌呤 （m/z 121.050873） 與 HP-0921 （m/z 922.009798）。

2.4 水稻葉片樣品分析系統液相及質譜條件

第一維液相色譜系統HILIC色譜條件： XBridge Amide色譜柱（250 mm × 4.6 mm， 3.5 μm）； 流動相組成： （A） 5 mmol/L NH3·H2O， （B） 5 mmol/L NH3·H2O （乙腈-水，9∶1，V/V），流速： 1 mL/min，進樣體積： 50 μL。梯度洗脫： 0～60 min， 90%～60% B； 60～80 min， 60%～40% B； 80～88 min，40%～10% B； 88～92 min， 10% B； 92～107 min， 90%B。 采用自動餾分收集器，餾分收集時間： 0～90 min，按照時間方式每分鐘收集為1個組分。 將組分按照時間順序編號（V1～V90）。根據文獻[20]報道，前10 min，高有機比例肽段含量較少，按照V1～V5、V6～V10 方式合并成2個組分； 編號V11～V90的組分按照順序合并成20個組分，共計22個組分，具體合并方式見圖1。合并后的組分通過真空旋轉濃縮至干，以0.1% 甲酸復溶，離心，取上清液，供第二維液相色譜分析。

第二維納升液相色譜系統采用Thermo EASY 1000 Nanoflow液相色譜儀，色譜條件： Acclaim PepMap RSLC色譜柱 （15 cm × 50 μm， 2 μm）和Acclaim PepMap 100 Trap柱（2 cm × 70 μm， 3 μm）； 流動相： （A） 0.1%甲酸， （B） 0.1%甲酸-乙腈； 流速： 0.3 μL/min； 進樣體積： 2 μL。梯度洗脫： 0～4 min， 4%～8% B； 4～106 min，8%～30% B； 106～116 min，30%～90% B； 106～120 min，90% B。

質譜鑒定利用Thermo LTQ線性離子阱質譜儀，質譜條件： Nano源，正離子掃描方式，設置離子傳輸毛細管溫度為300℃； 電噴霧電壓： 1.9 kV； 歸一化碰撞能量為35%。數據依賴模式對MS和MS/MS進行圖譜信息掃描，掃描方式為全掃描 （m/z 300～2000），全掃描中豐度最高的10個離子峰進行MS/MS掃描。動態排除 （Dynamic exclusion） 設置為： 重復次數為1次，動態排除時間 （Exclusion duration） 為30 s，采用Xcalibur軟件進行系統數據處理。

2.5 數據分析

質譜采集的數據通過Proteome Discoverer軟件 （Version 2.0 Thermo Fisher Scientific），利用SEQUEST HT檢索算法在水稻數據庫 （Oryza sativa subsp. Japonica （Rice）. fasta） 中進行檢索鑒定。檢索參數為： 胰蛋白酶酶切，允許最大漏切位點為2，前體離子的質量容忍度為20 ppm，碎片離子的質譜容忍度為0.6 Da，半胱氨酸殘基C端+57 Da設為固定修飾，Met （M） +15.995 Da設為可變修飾，使用Percolator卡值保證所有肽段鑒定信息假陽性率≤1%。

3 結果與討論

多維液相色譜系統由于各維色譜分離機理的差異，對復雜樣品分離表現出較高的分辨率和峰容量。多維液相色譜正交性是衡量各維色譜分離機理差異的一個指標，也是影響相色譜分離能力的重要因素[11]。

3.1 利用標準肽段評價二維液相色譜正交性

目前，肽段保留時間圖譜法 （Peptide retention time plots） 因其數據處理簡便和直觀，在利用標準肽段評價系統正交性分析中廣泛應用，以肽段在各維液相色譜的保留時間 （或相對保留時間） 為橫、縱坐標，繪制保留時間圖譜，計算保留時間線性回歸系數 （Correlation coefficient，R2），評價多維液相色譜正交性[21，22]。本研究在親水作用色譜和反相色譜系統中，利用標準肽段考察了各維液相色譜在不同酸堿度條件下對二維液相色譜系統分離正交性的影響，并選擇最佳酸堿度組合方式，實現二維液相系統正交性最大化[23]。在預實驗中，利用一維納升液相色譜系統預分離，結合質譜技術 （相關儀器參數見2.4節），分析肽段的等電點、疏水性、肽段長度 （氨基酸數）、質譜峰強度以及肽段在色譜中的保留時間，選擇氨基酸數目在8～30之間、肽段疏水性 （GAVAY） 在1.675～0.77之間，以色譜保留時間橫跨前、中、后時間段且質譜響應超過105的肽段為特征肽段 （見表1）。

參照文獻[21]，本實驗考察了親水作用色譜在酸 （pH 4.5）、中 （pH 6.8）、堿 （pH 9.3） 條件下及反相色譜在酸 （pH 3.3）、堿 （pH 9.3） 條件下對二維系統正交性的影響。本研究未討論反相色譜在中性條件下對分離度的影響，因文獻[24]表明反相色譜在中性條件下對大多數肽段的保留與在酸性條件下保留相似。如圖2所示，在任一酸堿度下，親水作用色譜和反相色譜均表現出明顯的分離正交性。值得注意的是，相比于反相色譜在堿性條件下，酸性條件的反相色譜與任一酸堿度下的親水作用色譜組合形成的二維液相色譜系統對標準肽段保留分布更加分散，校正保留時間線性擬合系數越小，正交性越好。因此，選擇pH 3.3作為反相色譜流動相的酸堿度。

在反相色譜流動相為酸性的基礎上，親水作用色譜從酸性上升到中性，21種標準肽段在二維液相色譜系統的正交性幾乎未受影響（圖2D和2E）； 但當親水作用色譜從中性上升到堿性，二維液相色譜對肽段的保留行為表現出明顯差異，校正保留時間線性擬合系數從0.59887降低到0.34113（圖2E和2F）。以肽段2和21為例， 親水性肽段2 （GRAVY=1.625） 從HILIC色譜柱到RP色譜柱的保留時間從50 min縮短到14 min； 疏水性肽段21 （GRAVY=0.503） 在兩維色譜的保留時間從25 min延長到116 min。綜上所述，pH 9.3和pH 3.3分別被選擇為親水作用色譜和反相色譜的流動相酸堿度。

此外，反相色譜因分離效率高、流動相與質譜兼容等優點被廣泛應用于二維液相色譜系統的最后一維 [12，23]，因此選擇親水作用色譜和反相色譜分別作為二維液相色譜系統的第一維和第二維。

3.2 結合餾分收集技術評價二維液相色譜技術在水稻葉片蛋白質分析中的正交性

根據3.1節的結果，本研究建立的二維親水作用-反相液相色譜分析21種特征標準表現出較好正交性，但其在分析復雜蛋白質組學實際樣品的正交性還需要進一步驗證。實際復雜蛋白質組學樣品在二維液相色譜結合餾分收集系統中的正交性評價主要通過分析質譜鑒定到的肽段在所有餾分中出現次數[19]及肽段在色譜中分離分布情況[24]。本研究通過分析實際水稻葉片中鑒定到的所有肽段在22個餾分收集組分中出現的次數，評價二維液相系統在實際樣品分析中的正交性。如圖3A所示，約50.7%肽段在22個餾分收集組分中出現次數不超過2次； 圖3B所示，一維液相色譜餾分收集組合后，肽段在第二維色譜及質譜分離分析中，可以較好地分布在不同時間段的洗脫窗口，此結果與文獻[13]一致，且21種標準肽段在實際樣品分析的22個餾分組分中均勻分布，說明采用親水作用-反相二維色譜法結合餾分收集技術分析水稻葉片蛋白質具有良好的分離正交性。

3.3 水稻葉片蛋白質結果分析

分蘗期水稻葉片根據2.2節樣品前處理后進行二維液相色譜-串聯質譜分析。由于實際樣品的復雜性以及質譜數據依賴模式無法在有限時間內分析所有的共洗脫肽段[19]，本研究每組分樣品進行3次重復質譜分析，將質譜分析數據在水稻蛋白質庫中進行檢索，3次重復共鑒定到207345個肽段，歸屬于2930個蛋白質簇，其中3次共同鑒定到的蛋白質簇為1374個，占3次鑒定蛋白質簇總數的51.1%，而單次鑒定到的蛋白質簇從第一次的235個逐漸減少到第三次的60個，第三次鑒定蛋白質簇數目僅約占鑒定總數的2.2%，說明3次重復質譜分析可實現對大多數蛋白質簇 （86.6%） 的可靠鑒定（圖4）。相比于Breci等[25]采用陽離子交換-反相二維液相色譜鑒定水稻葉片蛋白，本研究多鑒定到200349個肽段和2352個蛋白質簇。可能是由于相比于陽離子交換色譜，親水作用色譜更能提供較為特異性的分離能力[21，26]，使得肽段在梯度時間內均勻分布，相對延長了質譜采集時間，因而增加了蛋白鑒定量。在陽離子交換-反相系統中，為實現與質譜的良好匹配，色譜分離得到的高鹽分肽段混合物需要經過多步脫鹽，此過程可能會導致肽段損失，降低鑒定效率。

根據生物信息學工具PANTHER進行聚類分析[27，28]，考察了水稻葉片蛋白質的細胞組分、生物進程以及分子功能，具體分布如圖5所示，圖中數值代表具有該功能的蛋白質占總鑒定蛋白質的百分比。從分子功能分布圖（圖5B）可見，鑒定到的蛋白質其分析生物學功能主要有催化活性 （Catalytic activity）、結合活性 （Blinding activity）、結構組成 （Structural molecule activity）、運輸活性 （Transporter activity） 等，其中催化活性相關的蛋白質鑒定量約占55.1%，例如具有酶催化活性的蛋白質包括異構酶、氧化還原酶和水解酶等。

4 結 論

建立了親水作用-反相二維液相色譜串聯質譜鑒定水稻蛋白質的方法。堿性條件下 （pH 9.3） 的親水作用色譜和酸性條件下 （pH 3.3） 的反相色譜組合，提高了分離正交性； 在實際復雜水稻葉片樣品分析中，引入餾分收集技術，進一步提高了色譜分離的正交性，最終鑒定到207345個肽段，歸屬于2930個蛋白質簇。 結果表明，本方法是一種高正交性、高分辨率的蛋白質組學分析技術，適用于大規模的蛋白質鑒定分析，為植物蛋白質組學提供了新思路和技術方法。

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