鉛離子誘導PS2.M構象改變特性及其氡非標記比色傳感檢測新方法

劉紅文 季穎 宋春麗 田剛 李詩雅 楊桂英 呂昌銀

摘 要 以氡輻射衰變最終形成穩定的子體鉛作為目標檢測物，建立了檢測氡累積濃度的核酸適配體生物分析新方法。K+誘導富G單鏈核苷酸PS2.M形成反平行G-四鏈體四鏈體，輔因子血紅素與G-四聯鏈體結合，形成具有過氧化物酶活性的穩定復合物，催化TMB-H2O2體系發生顯色反應。同時加入Pb2+時，Pb2+誘導PS2.M形成結構更加穩定的“缺口”型反平行G-四鏈體，K+和血紅素游離在溶液之中，體系吸光度響應值急劇降低?；诖藰嫿艘环N基于Pb2+誘導PS2.M構象改變的過氧化物酶活性“Turn-off”型比色傳感器。在5.0×109～1.8×107 mol/L范圍內，吸光度降低值ΔA與Pb2+濃度呈線性關系，線性回歸方程為ΔA=0.36+0.13C， R=0.9987。本方法對Pb2+的檢出限為3.76 nmol/L （S/N=3），氡的檢出限為1.96×103 Bq·h/m3 （S/N=3）。本方法靈敏、準確，樣品溶液可直接檢測，操作簡單，避免了現場進行氡輻射劑量測量的放射性危害，為環境中氡的檢測提供了新方法。

關鍵詞 氡；子體鉛；核酸適配體；G-四鏈體；構象轉變；比色傳感

1 引 言

氡是天然放射系中唯一無色、無嗅、無味的氣體放射性元素，半衰期為3.82天，是室內放射性氣體污染物的主要存在形式[1，2]。經過一系列短壽命子體鏈的衰變，氡產生的穩定子體210Pb半衰期長達21年[3]。室內氡照射和吸煙具有協同效應，是導致肺癌的第二大殺手[4，5]。世界衛生組織與國際癌癥研究機構已將氡列為19種致癌物質之一[6]。研究表明，21世紀以來我國室內平均氡濃度較20世紀80年代和90年代分別上升了57%和42%[7]，室內氡污染的危害受到越來越多的關注。因此，科學有效地采集和檢測室內中的氡濃度，建立經濟、有效、簡便/快捷的檢測氡的累積輻射劑量的方法具有重要的衛生學意義[8]。

近年來，核酸適配體（Aptamer）已經廣泛應用于生命科學、臨床診斷、藥物篩選和環境科學等領域[9～11]。在重金屬離子的檢測中，核酸適配體得到了充分應用，Liu[12]和Jiang[13] 等利用Hg2+可以形成T-Hg-T結構，實現對Hg2+的高特異性和高靈敏度的檢測。Lu等[14]通過Pb2+能誘導富G核酸鏈-TBAA特異性形成G-四鏈體結構，從而實現Pb2+的高特異性和高靈敏度的可視化檢測。鄧歡等[15]將門控制效應和核酸適配體結合，構建檢測Pb2+的電化學生物傳感器。Long[16]與Deng[17] 等基于Pb2+誘導核酸適配體PW17和T30695構型改變導致體系熒光強度變化，開展了氡的非標記熒光傳感生物分析新方法研究。

G-四鏈體構象的穩定性與其所結合的陽離子種類有關，不同構型G-四鏈體與Hemin結合后催化活性差異明顯，表現出不同的過氧化物酶活性[18～20]。Kong研究組基于G-四鏈體與Hemin結合具有過氧化物酶活性，催化ABTS-H2O2系統顯色，構建了Ag+、Hg2+等重金屬的檢測平臺[21～23]。本研究根據氡輻射衰變特點，結合Pb2+的現代分析技術，研究了K+和Pb2+誘導PS2.M分別形成不同結構G-四鏈體的特性，建立了一種基于Pb2+誘導PS2.M構象改變的過氧化物酶活性“Turn-off”型比色傳感器，實現了Pb2+和氡的靈敏檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

UV-2550紫外-可見分光光度計（日本島津儀器公司）； J-815圓二色譜光譜儀（日本Jasco公司）； AB204-S電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）； PB-20（PB-S）型精度酸度計（德國賽多利斯公司）； 氡室（南華大學核工業第六研究所）； 混合纖維素膜（Merck Milipore公司）。

冰醋酸（HAc，天津市福晨化學試劑廠）； 三羥甲基氨基甲烷（Tris）、KCl（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 鉛標準溶液（100.0 μg/mL，中國計量科學院）； 富含鳥嘌呤的寡核苷酸鏈PS2.M（5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3'，上海生工生物工程股份有限公司合成）； 氯化血紅素（Hemin）、3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（TMB， 上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司）； HCl、H2O2（廣東光華科技股份有公司）； 實驗用水均為滅菌超純水（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

2.2 氡樣本的采樣方法[16]

以10 mL 0.2%（V/V）冰醋酸作為吸收液，以直徑70 mm、高17 mm一次性塑料培養皿為收集器，在平皿口加封混合纖維素膜（孔徑為0.8 μm，Milipore公司）； 設定采樣時間，將采樣器放入氡室，被動式采集含鉛樣本。采樣后密封狀態、室溫放置4天，經過氡的半衰期，用0.2%醋酸定容至10 mL，混勻，4℃保存，待測。

2.3 Pb2+標準溶液的紫外可見光譜測定[19]

在反應管中，依次加入一定濃度的Pb2+標準溶液、50 μL 100 mmol/L Tris-HAC緩沖液（pH=5.0）、10 μL 10 μmol/L K+標準溶液、 20 μL 25 μmol/L Hemin試劑和50 μL 1 μmol/L PS2.M溶液，充分混勻后，在室溫下反應20 min。然后加入30 μL 5 mmol/L TMB及20 μL 100 mmol/L H2O2，混勻，室溫下放置35 min后，加入50 μL終止液（2 mol/L HCl），用超純水定容至500 μL，混勻，用UV-2550紫外-可見分光光度計測定。

3 結果與討論

3.1 比色傳感原理

根據氡最終衰變成為子體鉛，210Pb的半衰期達21年的特點，本研究以子體鉛作為目標檢測物，研究建立氡濃度的核酸適配體生物分析新方法。氡是一種氣態放射物質，密度9.73 g/m3，易溶于水，本研究選擇稀醋酸作為吸收液，并用微孔混和纖維素膜覆蓋采樣器進氣口，排除了空氣干擾物，氡衰變后的子體鉛與稀醋酸發生化學反應，生成Pb2+。

如圖1所示，未加入Pb2+時，K+誘導PS2.M形成反式平行G-四鏈體，該四鏈體與輔因子血紅素（Hemin）結合，形成穩定的具有過氧化物酶活性的復合物，催化TMB-H2O2系統氧化顯色。當體系中同時引入Pb2+和K+時，這兩種離子競爭與PS2.M的反應，但由于Pb2+與之作用能力更強，誘導PS2.M發生構象改變，形成結構更加穩定的G-四鏈體，抑制了K+的誘導能力，使輔因子血紅素游離在溶液之中，抑制了TMB-H2O2體系氧化還原反應的進行，體系吸光度急劇降低。椐此，建立基于Pb2+誘導的PS2.M構象改變的比色法檢測Pb2+和氡[19]。

3.2 紫外-可見光吸收光譜和圓二色譜表征

由圖2可見，單獨TMB+H2O2體系不發生顯色反應 （曲線c）； 曲線a在451 nm處有最大吸收峰，說明K+誘導 PS2.M形成的G-四鏈體結合血紅素的復合物具有類過氧化物酶活性，對TMB-H2O2氧化還原反應具有明顯的催化作用； 曲線b在451 nm處吸光度明顯降低，其原因是Pb2+將K+從已經形成的反式平行G-四鏈體中競爭出去，使PS2.M構象發生改變，輔因子血紅素游離在溶液之中，抑制了TMB-H2O2體系的氧化還原反應，體系吸光度響應值急劇降低。

圓二色譜測定結果如圖3所示，體系溶液中只有PS2.M時，在260 nm處出現一個正峰，加入K+后，在295 nm處出現一個正峰，符合K+誘導PS2.M形成反平行G-四鏈體結構的特征[24]。在PS2.M中加入Pb2+后，在265 nm處有一個負峰，312 nm處出現一個正峰，這是被Pb2+誘導形成反平行G-四鏈體的峰的典型譜特征[24～26]。當向PS2.M溶液中同時加入K+和Pb2+時，295 nm處的正峰消失，只在312 nm處出現正峰，且“PS2.M+ K++Pb2+”體系和“PS2.M+Pb2+”體系的圓二色譜圖形非常接近，說明K+和Pb2+競爭與PS2.M反應，Pb2+的存在，抑制了K+誘導PS2.M構象改變的能力，也說明了Pb2+與PS2.M結合形成的G-四鏈體結構更穩定、更容易形成[24]。

3.3 實驗條件優化

改變Tris-HAc緩沖液的pH值，考察pH值對反應體系的影響。結果表明，pH值對體系吸光度變化值（ΔA）影響較大。pH=4.0～5.0時，隨pH值增大，ΔA值逐漸上升； pH=5.0～7.5時，隨pH值增大，ΔA值逐漸下降，因此選擇pH=5.0的Tris-HAc溶液維持體系的酸堿性。在pH=5.0條件下進行Tris-HAc緩沖液用量的優化，結果表明，當Tris-HAc緩沖液終濃度為10 mmol/L時體系吸光度值變化最顯著。

TMB作為一種顯色劑，其用量對體系吸收值有一定影響。實驗結果表明，用量為0.3 mmol/L時體系吸光度值變化顯著且反應穩定。Hemin作為輔助因子，用量為1 μmol/L時，體系吸光度值變化最顯著。

Pb2+與K+競爭誘導PS2.M發生構象改變需要一定的反應時間。實驗表明，加入PS2.M20 min后，ΔA值逐漸增大； 當時間超過20 min后，ΔA值變化比較平緩，故選擇20 min作為PS2.M最佳孵育時間?？疾炝薚MB與H2O2顯色時間對實驗的影響，最終選擇在反應40 min后加入HCl終止反應。

3.4 共存干擾物的影響

如圖4所示，10倍濃度的Bi3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、NH+4以及Cr3+和 Hg2+對160 nmol/L Pb2+測定的干擾很小。由于本方法通過采集氡的子體鉛進行氡的檢測，采樣時，在采樣器進氣口加封0.8 μm的混和纖維素微孔膜，保證氣體氡可以輻射進入采樣容器，以利于采集子體鉛，阻止了空氣中其它顆粒干擾物進入采樣容器。因此，這些干擾物質在樣品采集時大部分已被排除在容器外，其可能產生的影響被進一步降低，不干擾測定。

3.5 標準曲線與檢出限

測定Pb2+系列標準溶液的吸光度值A及未加Pb2+的試劑空白溶液的吸光度值A0。計算各反應的ΔA（=A0-A）值，繪制標準曲線。如圖5所示，體系的吸光度差值ΔA與Pb2+濃度在0.5×108～1.8×107 mol/L范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為ΔA=0.36+0.13CPb（108 mol/L），相關系數R=0.9987。對空白溶液平行測定11次，計算空白溶液的標準偏差為sb=0.165，按照CL=3sb/k計算出Pb2+的檢出限為3.76 nmol/L。

3.6 氡累積濃度的測定和模型建立

按照采樣方法，在南華大學核六所氡實驗室采集累積濃度分別為0.71、1.45、3.54、6.57、10.17、13.78、17.60、21.70和25.25（104 Bq·h/m3）的氡輻射樣品溶液，采用本方法進行測定，結果如表1。ΔA值隨著氡累積濃度的增加而增大，根據Pb2+的標準曲線回歸方程ΔA=0.36+0.13CPb（108 mol/L），可得知樣品中Pb2+含量也逐漸增加。由圖6可見，在一定范圍內，氡濃度與ΔA值呈現良好的線性關系：ΔA=0.089CRn+0.59， R=0.9906。由此可建立氡的累積濃度與子體鉛之間的定量測定模型。本方法對氡的檢測范圍為7.10×103～1.02×105 Bq·h/m3， 檢出限為1.96×103 Bq·h/m3 （3σ）。

3.7 樣品分析與方法學比較

我國GB/T18883-2002《室內空氣質量標準》規定，室內空氣應無毒、無害、無異常嗅味，其中放射性參數氡（222Rn）年平均值 400 Bq/m3（標準值），達到此水平建議采取干預行動以降低室內氡濃度。徑跡蝕刻法是中國國家標準方法，對氡累積濃度的檢出限為2.1×103 Bq·h/m3[27]，本方法對氡累積濃度的檢出限為1.96×103 Bq·h/m3（< 2.1×103 Bq·h/m3），檢出限更低。

按照采樣方法，采集了2個氡樣本，用本方法與美國RAD7測氡儀進行對比測定。結果如表2，對兩種方法t檢驗結果表明，在可信區間為95%的范圍內，計算出t1=1.35，t2=0.59，均小于理論值t0.05（10）=2.228， 按照α=0.05的水平接受H0，即差異沒有統計學意義，可認為兩種方法測定結果的總體均數相同，證明本方法測定的結果可靠。

4 結 論

以氡輻射衰變最終形成穩定的子體鉛作為目標檢測物，建立了檢測氡累積濃度的核酸適配體生物分析新方法。本方法儀器設備簡單、操作簡單快速、抗干擾能力強、靈敏度高，Pb2+的檢出限為3.76 nmol/L，氡的檢出限為1.96×103 Bq·h/m3。在核科學和物理學中，一般針對氡輻射產生的α射線測定氡的累積濃度。本方法避免了現場進行氡輻射劑量測量的放射性危害，具有良好的應用潛能。

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