雙功能石墨烯量子點的制備及在pH熒光檢測和細胞成像中的應用

嚴平 李在均

摘 要 為改善石墨烯量子點的光學性質，設計并合成了五乙烯六胺和十二胺功能化石墨烯量子點（PEHA-GQD-DA）。將檸檬酸和五乙烯六胺混合，170℃熱解0.5 h后加入十二胺，繼續反應1.5 h得到PEHA-GQD-DA。PEHA-GQD-DA由尺寸僅為1～3 nm的石墨烯片組成，片邊緣含有豐富的功能基團。五乙烯六胺的引入顯著提高了量子點的熒光發射，熒光量子產率達到72.7%，明顯高于單獨檸檬酸熱解所制備的石墨烯量子點。引入十二胺，使PEHA-GQD-DA容易通過細胞膜磷脂雙分子層進入到細胞內部。PEHA-GQD-DA對環境pH值表現出極佳的光學響應行為。在pH 1.0～6.5時，熒光強度隨pH值增加而線性增強。隨pH值的變化，熒光光譜也發生改變，最大發射波長與pH值之間存在良好的線性關系。在pH 6.5～12.0時，熒光光譜不再隨pH值變化而變化，但熒光強度隨pH值增大而線性減少。常見無機離子和小分子化合物不影響PEHA-GQD-DA對pH值的熒光響應。PEHA-GQD-DA已成功應用于環境水樣pH值的熒光檢測和Hela細胞成像。

關鍵詞 雙功能石墨烯量子點；光學性能；pH探針；生物成像

1 引 言

pH值對細胞代謝、增殖、吞噬作用、離子轉運、信號轉導、凋亡等生命過程影響都有一定影響[1]。pH值的微小變化可能引發系列生命現象改變，因此，監測pH值變化是探索細胞功能和了解細胞內化的重要途徑[2]。pH值異常變化可能造成細胞功能紊亂，導致細胞功能障礙、炎癥、缺血性中風、類風濕性關節炎、囊性纖維化、癲癇發作以及心肺和神經退行性疾病[3]。血液pH值<7.35，屬于酸中毒，是需要治療的嚴重疾病。酸中毒多為某種疾病并發癥[4]。代謝性酸中毒可由腹膜炎、休克、高熱、腸瘺、急性腎衰竭等引起[5]，而呼吸性酸中毒則是由腦膜炎、血栓、脊髓灰質炎、支氣管哮喘以及廣泛性肺疾病引起[6]。血液pH值>7.45，屬于堿中毒，也是需要治療的嚴重疾病[7]。哺乳動物細胞正常生理條件下的外液略呈堿性，在腫瘤形成情況下，pH值較正常值偏低[8]。因此，精確測定pH值具有重要的理論和實際應用價值。

測定pH值常用pH響應電極、傳感器和試紙。pH電極和傳感器在使用中存在一些限制，包括需要參比電極和頻繁的校準、對電活性成分敏感以及信號不穩定[9]。pH試劑使用方便，但測定精度不高。上述方法都不適合細胞內pH值的測定。近年來， 對pH值響應的有機[10]和無機發光材料[11]引起廣泛關注。主要的發光材料有半導體量子點[12]、金屬納米簇[13]、非金屬納米簇[14]、碳量子點[15] 和石墨烯量子點[16]。不同于傳統方法，光學探針法是一種非接觸式方法，更適合細胞水平上的pH值監測。此外，熒光探針法還具有操作簡單、檢測快速和靈敏高等特點。然而，現有光學材料在生物相容性性、發光效率和通過細胞膜磷脂雙分子層的能力方面仍不理想。

石墨烯量子點是一種準零維的納米材料，尺寸僅有幾納米，具有顯著的量子局限效應和獨特的光電性能[17，18]。相比于半導體量子點，石墨烯量子點具有更好的生物相容性、發光強度、光穩定性和環境友好性[19]。目前，石墨烯量子點已應用于太陽能電池[20]、光學器件[21]、生物標記[22]、細胞成像[23]、電化學傳感器[24]、超級電容[25]和鋰離子電池[26]等方面。為進一步改善pH值光學響應，本研究設計合成五乙烯六胺（PEHA）和十二胺（DA）雙功能化石墨烯量子點（PEHA-GQD-DA）。PEHA-GQD-DA具有優異的光學性能，并被用于水樣pH值熒光檢測和Hela細胞成像。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Cary Esclipse熒光光度計（美國瓦里安公司）； JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）； Nicolet iS50 FT-IR傅立葉紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）； S-4800場發射掃描電子顯微鏡（日本日立株式會社）； TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

檸檬酸（CA）、五乙烯六胺（PEHA）、十二胺（DA）、NaOH、H3PO4、乙酸和H3BO3（國藥集團化學試劑公司）。BR緩沖溶液：將0.04 mol/L H3PO4、乙酸和H3BO3混合，加入不同體積的0.02 mol/L NaOH，得到不同pH值的BR緩沖溶液。實驗用水均為二次蒸餾水。

2.2 PEHA-GQD-DA制備

在25 mL燒杯中，加入4.2 g一水檸檬酸，用5 mL水溶解，邊攪拌邊滴加1.86 g PEHA。將燒杯轉移至烘箱中，于100℃下加熱除去游離水，升溫至150℃并保溫0.5 h，然后降溫至100℃。在劇烈攪拌下加入15 μL DA，升溫至160℃，繼續反應1.5 h，冷卻至室溫。將得到的PEHA-GQD-DA配制成0.05 mg/L的溶液，用1 mol/L NaOH調節至pH 7，用0.22 μm濾膜過濾，在截留分子量3 kDa的透析袋中透析24 h，得量子點儲備液，4℃保存，備用。

2.3 熒光檢測

將200 μL PEHA-GQD-DA工作液（0.05 mg/L）轉移至2 mL離心管中，依次加入200 μL水（或環境水樣）和600 μL BR緩沖溶液（pH 7.0），搖勻，以360 nm為激發波長，測量熒光光譜或熒光強度。

2.4 細胞成像

將Hela細胞轉移到含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中，在37℃、5%CO2條件下培養。成像實驗前，將細胞轉移至共聚焦專用培養皿，培養6 h，用5 mL PBS緩沖溶液（pH 7.4）洗滌3次。加入20 μg/mL PEHA-GQD-DA溶液，于37℃、5%CO2的條件下培養4 h，用5 mL PBS緩沖溶液（pH 7.4）洗滌3次， 去除殘余量子點，選擇490 nm激發光，在共聚焦熒光顯微鏡上進行熒光成像。

3 結果與討論

3.1 PEHA-GQD-DA制備

PEHA-GQD-DA制備包括二步熱解反應，如圖1所示。首先，以檸檬酸和PEHA混合物為碳源熱解形成PEHA-GQD。然后，PEHA-GQD再與DA縮合得到PEHA-GQD-DA。檸檬酸主要是通過分子間脫水及隨后的碳化過程形成由sp2碳原子組成的石墨烯片[27]。PEHA和DA都是功能性試劑，通過分子中的氨基與檸檬酸分子中的羧基縮合將功能基團引入到石墨烯片的邊緣，實現石墨烯量子點的功能化。PEHA分子中有6個氮原子，它的強供電子作用顯著增加了石墨烯片的電荷密度，從而提高了石墨烯量子點的熒光發射性能。此外，PEHA分子中的NH和NH2基團可通過在不同酸度下的質子化和離解改變石墨烯片的電學特征，使石墨烯量子點能對介質pH值改變產生靈敏的光學響應。盡管DA也能產生供電子效應，對石墨烯量子點熒光增強起到一定作用，但它的主要功能是在石墨烯片邊緣引入疏水性烷基鏈。烷基鏈的引入使PEHA-GQD-DA具有典型的雙親結構，以有利于量子點通過細胞膜磷脂雙分子層而進入到細胞內部。另一方面，檸檬酸、PEHA和DA都是化學活性化合物，在加熱條件下，同種分子或不同分子之間可縮合形成多種碳納米材料，這可能直接影響到產物純度和光學性能。然而，兩步熱解法可較好地解決這一問題。在室溫下，在第一步反應中，檸檬酸與PEHA通過酸堿反應形成鹽； 然后，在高溫下，熱解形成PEHA-GQD。由于150℃的反應溫度超過了檸檬酸分子縮合和碳化以及檸檬酸中羧基與PEHA中胺基縮合反應的溫度，但并未達到PEHA的碳化溫度，因此反應產物中不存在PEHA碳化產生的碳納米材料。第一步反應完成后，檸檬酸被轉化為石墨烯片，PEHA被共價連接到石墨烯片邊緣。因此，在第二步反應中，只有石墨烯片邊緣上的羧基能與DA分子中的胺基反應，以實現對PEHA-GQD的功能化。

為考察PEHA用量的影響，通過改變PEHA和檸檬酸的比例（PEHA/CA）制備了系列PEHA-GQD。圖2A是PEHA-GQD的熒光光譜。當PEHA/CA<0.4時，隨PEHA的比例增大，熒光強度迅速增強。這種熒光增強效應主要歸因于PEHA的供電子效應。一方面，PEHA含有氨基和亞氨基兩種強供電子基團，增加了石墨烯片電子云密度，從而導致熒光發射強度增加。采用更高比例的PEHA將引入更多的供電子基團，因此導致更強的熒光發射。另一方面，PEHA和檸檬酸可通過酸堿反應形成鹽。PEHA的供電子效應將提高檸檬酸的化學活性，檸檬酸分子更容易脫水縮合形成更多的石墨烯片，從而導致熒光強度的增加。圖2B是不同PEHA-GQD的紫外-可見吸收光譜， 在350 nm處有一個較強的吸收峰，它的最大吸收波長明顯大于小分子化合物的紫外吸收，證明形成了具有較大電子共軛體系的石墨烯片。隨著PEHA比例的增加， 350 nm處的吸光度迅速增加，說明形成了更多的石墨烯片。當PEHA的比例>0.4時，熒光發射強度和吸光度都明顯下降。這可能是因為檸檬酸與PEHA之間的化學反應消耗了檸檬酸分子中的羧基，使檸檬酸熱解形成石墨烯片的能力下降，甚至不能形成石墨烯，從而導致熒光強度降低。為了得到高的熒光發射，選用PEHA/CA=0.4的條件制備PEHA-GQD。

通過改變DA的加入體積，考察了DA用量對PEHA-GQD-DA光學性質的影響。從圖3A可見，PEHA-GQD-DA的熒光發射強于PEHA-GQD，說明DA的引入進一步提高了熒光強度。這是因為DA分子中存在強供電子氨基，進一步改善了量子點的熒光發射強度。然而，當DA加入量>15 μL時，體系中將析出沉淀，降低了水溶液中PEHA-GQD-DA的濃度， 從而導致熒光強度降低。這可能是因為石墨烯片邊緣上引入較多的烷基鏈，導致水溶性明顯降低。因此，本研究選用15 μL DA制備PEHA-GQD-DA。

3.2 結構表征

采用透射電鏡、原子力顯微鏡和紅外光譜對PEHA-GQD-DA的結構進行表征，結果見圖4。PEHA-CD-DA由準零維的石墨烯片組成，石墨烯片形貌單一，未發生明顯的團聚現象，尺寸在1～3 nm之間，平均片徑為2.2 nm，小于單獨檸檬酸制備的石墨烯量子點的平均片徑（5.6 nm）。這是因為PEHA可與檸檬酸能迅速反應，形成穩定的共價鍵，消耗了檸檬酸分子中的部分羧基，使石墨烯片的生長受到限制，導致形成較小的石墨烯片。通常，尺寸越小，量子限制效應更明顯，可能產生更強的熒光發射。3500～3300 cm1之間的吸收帶是NH鍵的對稱伸縮振動峰，3500 cm1處的吸收峰為OH鍵的對稱振動峰，3000～2800 cm1之間的吸收帶是CH鍵的伸縮振動峰，1741、1218、1066和1723 cm1處的吸收峰是COOH基團的伸縮振動，3162、1643和1535 cm1處的吸收峰是CONH基團的紅外吸收。以上紅外光譜的分析結果證明，PEHA-GQD-DA中含有OH、 NH2和COOH等功能基團。

3.3 光學性質

圖5是PEHA-GQD-DPA的熒光激發光譜和熒光發射光譜。PEHA-GQD-DPA的激發光譜在356 nm處有一個強的吸收峰，最大吸收波長明顯大于小分子化合物，說明形成了具有更大電子共軛體系的石墨烯片[28]。

PEHA-GQD-DPA的熒光發射峰位于375～600 nm之間，最大發射波長為450 nm。PEHA-GQD-DPA的熒光量子產率達到72.7%（以羅丹明B為標準物采用參比法測定），明顯高于以單一檸檬酸為碳源制備的石墨烯量子點（17.2%）[29]，說明PEHA和DA的引入顯著提高了石墨烯量子點的熒光發射。用氙燈（300 W）對裝有PEHA-GQD-DA溶液的石英比色皿持續照射，每隔10 min測量溶液在450 nm處的熒光強度。PEHA-GQD-DA溶液的熒光強度在70 min照射時間內基本不變，光穩定性良好。

3.4 對pH值的熒光響應

圖6是不同pH值下PEHA-GQD-DA的熒光發射光譜。當介質pH值<6.5時，石墨烯量子點的熒光強度（Fp）隨pH值增加而增大，其線性方程為Fp=152.72pH-15.85，相關系數R2=0.998。同時，不同pH值下熒光光譜也存在明顯差異。最大發射波長（W）與pH值之間存在良好的線性關系，線性方程為W（nm）=6.2539pH + 478.15，R2=0.996。因此，熒光強度和最大發射波長均可用于酸性范圍內pH值的定量測定。然而，堿性范圍內pH值變化不會引起石墨烯量子點的發射光譜變化。隨著pH值增加，熒光強度迅速下降，Fp與pH值保持良好的線性關系，線性回歸方程為Fp=113.83pH+1536.6，R2=0.995。因此，熒光強度的變化可用于堿性范圍內pH值的定量測定。PEHA-GQD-DA含有豐富的含氧基團，因此熒光信號的變化應主要歸因于含氧基團的質子化和離解。

PEHA-GQD-DA的主要功能基團是氨基、亞氨基、羥基和羧基，它們可能與過渡金屬離子配合，干擾pH值的光學響應。為評估pH值測定的選擇性，分別測定了加入不同干擾組分后石墨烯量子點體系的熒光光譜變化。結果表明，1.0 mg/mL的Li+、Ag+、Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Al3+、Cl、SO24或CO23的引入，僅引起峰熒光強度的微小變化（圖7），熒光強度仍保持在最初強度的95%以上。除無機離子外，環境和細胞內還可能存在一些有機小分子化合物，它們可能與石墨烯量子點之間相互作用，導致體系熒光發射的改變。研究表明，1.0 mmol/L的葡萄糖、多巴胺、草酸、尿素、谷胱甘肽、賴氨酸的存在并不影響量子點對介質pH值的熒光響應。因此，本方法具有較好的選擇性。

3.5 實際水樣pH值的測定

為檢驗PEHA-GQD-DA用于水樣pH值測定的實用性，收集了3個環境水樣品（自來水、雨水和湖水）和2個電鍍廢水樣品，按2.3節所述方法進行熒光測定，結果列于表1。本法測定結果與酸度計的測定結果具有較好的一致性，表明本方法具有較高的實用性。

3.6 腫瘤細胞成像

采用CCK-8方法對PEHA-GQD-DA的細胞毒性進行測試。結果表明，PEHA-CD-DPA濃度在0～1000 μg/mL之間，細胞活力保持基本不變，說明PEHA-GQD-DA具有非常低的細胞毒性。將Hela細胞與PEHA-GQD-DA孵育不同時間，然后在共聚焦顯微鏡上進行熒光成像。從圖8可見，PEHA-GQD-DA處理2 h后，細胞產生較強綠色熒光，且熒光強度不再隨孵育時間的延長而增強，說明大部分PEHA-GQD-DA已進入到細胞內部。然而，同樣條件下用GQD處理的細胞的熒光卻很弱。當延長孵育時間到8 h，GQD處理的細胞熒光強度才達到最大，但仍十分微弱。PEHA-GQD-DA細胞成像能力較好，主要歸因于它的特殊結構：一方面，PEHA的引入提高了熒光強度，使成像更為清晰； 另一方面，DA的功能化提供了特殊的雙親結構，使量子點更易通過細胞膜磷脂雙分子層而進入到細胞內部，避免了水溶性量子點滯留在細胞外的問題。

4 結 論

通過引入供電子基團和烷基鏈， 成功合成了一種雙功能石墨烯量子點，可作為各種光學檢測和生物成像的熒光探針。通過構建具有不同離解和質子化的功能基團體系，可實現對介質pH值靈敏光學響應，可用于不同需求下pH值的精準測定及實時監測。研究結果表明，功能基團的引入可改變石墨烯量子點的性能，明顯改善其光學性能，為設計基于石墨烯量子點的新型熒光材料提供了參考。

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