人參皂苷Re在正常和中波紫外線輻射損傷模型大鼠體內藥代動力學比較研究

孫巖 肖楠 李光 韓燕燕 劉淑瑩 王恩鵬 陳長寶

摘 要 建立了超高效液相色譜-三重四級桿質譜（UPLC-QQQ-MS）檢測大鼠血漿中G-Re含量的方法，用于比較研究人參皂苷Re（Ginsenoside Re， G-Re）在正常大鼠和UVB輻射損傷模型大鼠體內的藥代動力學行為。選用Ascentis Express C18 色譜柱（5.0 mm × 3.0 mm，2.7 μm），以0.1%甲酸-乙腈為流動相，梯度洗脫。電噴霧離子源（ESI）在負離子模式下，選擇多反應監測模式（MRM）掃描，內標法定量，用于G-Re定量分析的離子為m/z 991.54/945.53/475.60。方法檢出限為4.0 ng/mL，定量限為13.5 ng/mL，G-Re在15～20000 ng/mL范圍內線性關系良好（r =0.999）；日內和日間精密度、回收率、基質效應和穩定性均能滿足藥代動力學分析要求。結果表明，兩組大鼠分別單次口服50 mg/kg G-Re后，體內代謝過程表現皆符合二室模型特征， 正常組和模型組t1/2α分別為（0.21±0.04）h和（0.69±0.07）h，t1/2β分別為（17.08±0.53）h和（21.40±16.77）h，AUC（0-t）分別為（321.91±2.27） g/（L·h）和（474.99±194.96）g/（L·h），AUC（0-∞）分別為（332.44±1.66） g/（L·h）和（518.64±231.39）g/（L·h），除t1/2α外，兩組之間的藥代動力學參數具有顯著差異（p<0.05）。本方法準確、靈敏、專屬性強、穩定性好，可用于人參皂苷Re的體內藥代動力學比較研究。

關鍵詞 人參皂苷Re； 中波紫外線輻射； 藥代動力學

1 引 言

紫外線輻射具有強烈的生物學效應，長期暴露于紫外輻射，尤其是中波紫外線（Ultraviolet B，UVB），對皮膚可產生強烈的光損傷，被照射部位真皮血管擴張，皮膚會出現紅斑、炎癥、老化現象，嚴重者可引發皮膚癌[1～5]。過量的UVB照射可導致機體中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）下降，由照射產生的自由基及活性氧可以攻擊免疫器官，導致其氧化損傷，免疫細胞的及細胞因子分泌發生改變，繼而機體的免疫功能逐漸減弱，甚至產生免疫抑制作用[6～8]。藥物代謝動力學是定量研究藥物在生物體內吸收、分布、代謝和排泄規律，并運用數學原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化的規律的學科。近年來，質譜技術在藥代動力學研究方面的應用較為廣泛[9～11]，但是機體受UVB輻射損傷狀態下的相關代謝研究鮮有報道。

人參（Panax ginseng C.A.Mey.）具有良好的抗輻射功效，人參皂苷作為人參的主要活性成分之一，在抗氧化、清除氧自由基和抗衰老等方面具有較強的活性[11～15]。人參皂苷Re的質量分數約占總皂苷的30%，具有清除自由基，保護不飽和脂肪酸等活性，有顯著的抗衰老功效，發揮著重要的抗腫瘤和抗癌作用[16～20]。

本研究利用超高效液相-質譜聯用技術，檢測人參皂苷Re經正常和UVB輻射損傷模型大鼠口服后的血藥濃度變化情況，計算相關的藥代動力學參數，比較兩組間的差異，為初步揭示紫外線輻射對機體代謝的影響提供理論依據，同時也對人參皂苷Re的藥用開發與基礎研究提供了參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200型液相色譜系統，6520 Accurate Q-TOF儀， TSQ ENDURA質譜儀，配有ESI離子源及Xcalibur數據處理系統，均購自美國Agilent公司；Thermo UltiMate 3000系統；TDL-5-4型離心機（Anke公司），WS2-261-79高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；超低溫冰箱（美國熱電公司）；窄譜中波紫外線光源采用飛利浦紫外線燈（TL-01，峰值311～313 nm）；紫UV-340A外線輻照計（臺北路昌公司）。

乙腈（色譜級，美國Tedia公司）；甲酸（色譜級，美國Sigma公司）；人參皂苷Re和人參皂苷Rf對照品（純度>98%，吉林大學有機化學教研室）；超純水由美國Millipore公司的Milli-Q系統制得。

2.2 實驗動物

雄性Wistar大鼠12只，體重（180±20） g，動物合格證號：SCXK-（遼）2015-0001，由遼寧長生生物技術有限公司動物中心提供。在標準環境下（濕度 50%±10%；溫度（25±2）℃；12 h 晝夜循環）進食進水，放入代謝籠內適應性飼養3天，實驗前禁食12 h，實驗過程中所有動物都受到精心養護。

2.3 色譜與質譜條件

Ascentis Express C18 色譜柱（5.0 mm×3.0 mm，2.7 μm），柱溫35℃。流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序：0 min，20% B；0～2 min，20% B；2～4 min，20%～35% B；4～7 min，35%～41% B； 7～9 min，41%～70% B；9～10 min，70%B。 流速 0.3 mL/min；進樣量5 μL。

質譜條件：碰撞氣為超純氦，鞘氣和輔助氣為高純氮；電噴霧電離（ESI），檢測模式為負離子模式；鞘氣壓力：35 psi；輔氣壓力：10 psi；離子轉運管溫度：325℃；氣化溫度：275℃；采用多反應監測（MRM）方式檢測。

2.4 溶液配制及樣品處理

2.4.1 標準溶液及內標溶液的配制 稱取人參皂苷Re 標準品1.00 mg，用甲醇稀釋至1.0 mL，配成濃度為1.0 mg/mL母液，然后用甲醇稀釋成0.5、1.0、10.0和100.0 μg/mL的工作液。稱取人參皂苷Rf 標準品1.00 mg，以甲醇定容至1.0 mL，配制成1.0 mg/mL的內標溶液，然后用甲醇稀釋成1.0 μg/mL的工作液。

2.4.2 標準曲線的繪制 取空白大鼠血漿100 μL 于1.5 mL Eppendorf 管中，每個樣品中加入不同質量的人參皂苷Re，配成15、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000和20000 ng/mL的系列標準溶液，加入100 μL 1 μg/mL人參皂苷Rf 作為內標， 混勻，加入200 μL冰甲醇，渦旋30 s，12000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm濾膜過濾后進樣檢測。以G-Re 濃度為橫坐標x，以G-Re 與G-Rf的峰面積比值（A/Ai）為縱坐標y，進行直線回歸，得標準曲線。

2.5 實驗方法

參考文獻[21]的方法對大鼠造模[21]，取上述雄性大鼠12只，用嬰兒理發器剃除整個大鼠背部（尾部至頸部）的絨毛，每2天剃毛1次，實驗前隨機分成空白對照組與UVB模型組，每組6只。UVB照射時，大鼠背部暴露在距光源30～42 cm處，每次劑量為170 mJ/cm2，連續UVB照射5天，從第6天開始，每2天照射一次，共14天（10次），UVB總劑量為2.38 J/cm2，照射后送回動物飼養室。

空白對照組與UVB模型組繼續按照上述照射條件飼養至第15 d，口服G-Re皂苷（混懸于0.5% CMC-Na） 50 mg/kg劑量混合液，在0.08、0.17、0.33、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12、24、36、48和72 h眼眶取血，每個時間點取血0.5 mL，血液冷卻后3000 r/min離心10 min，取上清血漿100 μL，測定前加入100 μL G-Rf內標液和 300 μL冰甲醇，渦旋30 s，以12000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，于4℃保存， 待測。

3 結果與討論

3.1 質譜條件的鑒定及優化

利用高分辨飛行時間質譜儀在負離子模式下對人參皂苷Re、Rf進行定性分析，結果見圖1。分別在正、負離子模式下，采用直接進樣方式，優化G-Re和內標G-Rf的三重四級桿質譜的分析條件：毛細管電壓為2.0 kV；離子傳輸管溫度為200400℃；霧化器溫度為200400℃；鞘氣流速2050 psi；輔助氣流速0.3 L/min；自動優化G-Re和內標G-Rf在多反應檢測（MRM）時所產生的碎片離子種類和所需碰撞能量。本研究選擇負離子模式進行分析，詳細參數見表1。

3.2 方法學考察

3.2.1 專屬性 將供試空白血漿與空白血漿中加入待測物和內標物后得到的總離子流圖（Total ion chromatorgram， TIC）和給藥后不同時間實測色譜圖進行比較。結果表明，血漿中所含內源性物質不干擾被測物和內標物的測定，被測物峰形良好。G-Re和內標G-Rf 的保留時間分別為4.61和6.52 min。空白大鼠血漿樣品，空白大鼠血漿中加入G-Re和內標G-Rf樣品，給藥1 h后的大鼠血漿樣品如圖2所示。

3.2.2 線性關系 將G-Re與內標G-Rf的峰面積比值（y）與G-Re濃度（x）進行最小二乘線性回歸。結果表明，在15～20000 ng/mL濃度范圍內，線性關系良好，得到標準曲回歸方程為y=0.0003x+0.0009（R=0.999）， 檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為4.0 ng/mL和13.5 ng/mL。

3.2.3 精密度與準確度 采用高、中、低3個濃度的G-Re血漿QC樣本，每個濃度進行6個樣本分析，連續測定3天，計算日內和日間精密度和準確度，結果見表2。日內和日間精密度的相對標準偏差（RSD）均小于5%，表明本方法的精密度和準確度良好。

3.2.4 回收率 分別取G-Re高、中、低3個濃度的QC樣本，每個濃度進行6個樣本分析，將空白血漿中先加入G-Re，處理后計算所測得峰面積，與空白血漿處理后加入相同量G-Re所測得峰面積比值的百分率進行比較，考察樣品的提取回收率，結果見表2。G-Re回收率范圍為89.6%～91.9%， RSD<15%， 表明本方法可以滿足血漿類生物樣本的檢測要求。

3.2.5 基質效應 分別取G-Re高、中、低3個濃度的QC樣本，與等量G-Re的純標準溶液的峰面積相對應，測量基質效應， 基質效應（%）=A/B×100， 其中A為QC樣本中測得G-Re的峰面積， B為等量G-Re標準溶液的峰面積，每個濃度進行6個樣本分析，結果如表2所示，G-Re在3個濃度下的基質效應在93.2%～97.8%之間，表明本方法可有效避免基質對人參皂苷Re測定的影響。

3.2.6 穩定性 分別取G-Re高、中、低3個濃度的QC樣本，在不同的儲存條件（室溫24 h，20℃至少15天，3次凍融循環后和4℃下保存8 h）下， 3個QC水平的測定結果見表3。結果表明，在上述條件下，人參皂苷Re樣本溶液較為穩定，可滿足分析要求。

3.3 人參皂苷Re的藥代動力學比較研究

利用本方法研究大鼠口服50 mg/kg的G-Re后的藥代動力學行為。用DAS 2.0軟件對數據進行處理，其主要藥代動力學參數詳見表4。圖3為口服后空白組和模型組大鼠的平均血液藥物濃度-時間曲線， 通過赤池信息標準（Akaike's information criterion， AIC） 進行房室模型分析，結果表明，G-Re在兩組大鼠體內代謝符合二室模型特征。經統計學t檢驗分析，與正常狀態下的藥動學參數比較， 在UVB輻射條件下， G-Re在大鼠體內的t1/2β、 AUC、 Tmax和K21均高于正常組，兩者之間有顯著性差異（p<0.05），提示在UVB狀態下G-Re在大鼠體內的吸收明顯升高，而Cmax、 K12和K10無統計學差異，提示在大鼠體內的消除沒有發生明顯變化[22]。有研究報道，在輻射劑量為800 mJ/cm2 UVB急性照射下，即可導致裸鼠肝細胞GSH與SOD活性水平顯著下降[23]。本實驗在UVB照射劑量下，模型組大鼠肝臟可能造成了一定的氧化損傷，從而導致其對G-Re的吸收、分布、代謝及排泄過程產生了影響[23] 。

本實驗建立了UPLC-QQQ-MS/MS 法對正常和UVB輻射損傷模型大鼠體內G-Re含量的快速檢測方法。利用超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用的優勢，對質譜參數進行了優化，對檢測的G-Re和內標G-Rf都分別選擇一個定性離子對和一個定量離子對，最終實現對G-Re的定量分析。此方法可在10 min內完成G-Re的分析，檢測時間短、線性關系較好、方法回收率高、穩定性良好，可滿足分析要求。本實驗對正常大鼠和UVB輻射大鼠體內的人參皂苷Re藥代動力學比較研究，對比兩組代謝檢測結果，UVB輻射條件下測得大鼠體內的人參皂苷Re含量較高，說明中波紫外線影響人參皂苷Re在動物體內代謝過程，其詳細機制有待于進一步研究。

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