雙殼貝類消化系統中微塑料的分離鑒定及應用研究

丁金鳳 李景喜 孫承君 何昌飛 蔣鳳華 高豐蕾 鄭立

摘 要 通過比較10% KOH和30% H2O2消解體系，建立了分離貝類消化系統中微塑料的前處理技術，采用傅里葉變換顯微紅外光譜儀（μ-FT-IR）和體式顯微鏡實現了微塑料的定性與定量分析，并用于檢測櫛孔扇貝和紫貽貝中的微塑料。結果表明，10% KOH消解體系的消解效率較高，聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚乙烯（Polyethylene，PE）、聚苯乙烯（Polystyrene，PS）和聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）加標回收率為96.7%～98.6%，方法精密度較好，相對標準偏差≤ 3.2%，能夠滿足檢測要求。檢測了青島5個大型水產品市場采集的市售櫛孔扇貝（50個）和紫貽貝（50個），以及野生紫貽貝（15個）中的微塑料，貝類中微塑料的個體檢出率達80%以上，野生貝類中微塑料的個體檢出率僅為40%。不同市區市售櫛孔扇貝中微塑料平均豐度變化范圍為5.2～19.4 個/個體和3.2～7.1 個/g（消化系統組織濕重），不同市區市售紫貽貝中微塑料平均豐度變化范圍為1.9～9.6 個/個體和2.0～12.8 個/g，其中，市售紫貽貝中微塑料的平均豐度（1.9個/個體，3.17個/g）高于野生紫貽貝中微塑料的平均豐度（0.53 個/個體，2.0 個/g）。在貝類中分離到纖維、碎片和顆粒3種形狀的微塑料，其中，纖維狀微塑料的豐度最高且平均粒徑最大。不同市區貝類消化系統中的微塑料隨著粒徑增大，數量呈遞減的總體趨勢，其中，小于500 μm的微塑料占微塑料總量的26%～84%。貝類中豐度最高的微塑料的聚合物成分是賽璐玢（Cellophane，CP），其次是聚丙烯（Polypropylene，PP）。本方法具有簡單、高效、對樣品中微塑料損害低等優點，適用于海產品中微塑料的檢測分析。

關鍵詞 微塑料；雙殼貝類；消化系統；微塑料污染；紅外光譜

1 引 言

塑料及其制品被人類廣泛使用，它在給人類的生活和社會生產帶來便利的同時，廢棄塑料垃圾大量累積，也對環境造成了污染。據報道，全球每年生產的塑料超過3 億噸，其中約有10%的塑料會通過河流輸入等方式進入海洋[1]，在物理、化學、生物等共同作用下[2]，大片塑料被分解成較小的碎片，當形成粒徑<5 mm的顆粒時，可稱之為微塑料[3]。由于塑料的化學性質較為穩定，可在海里留存上百年甚至數千年[4]。微塑料具有顆粒比表面積大、疏水性強等特點，易吸附持久性有機物[5，6]及重金屬[7]等污染物。微塑料在海洋中或漂浮于海水中，或沉降于海底成為沉積物的組分[8]，吸附污染物的微塑料被浮游動物和底棲動物攝食后，對生物有直接的毒害作用，并且可通過食物鏈傳遞效應在生物體內富集[9～12]。在生物腸道條件下，微塑料吸附的污染物解吸速度比在單獨的海水中高30 倍[13]，因此，海洋環境中的微塑料最終可能會危及人類的健康。

雙殼貝類是底棲濾食性生物的優勢類群，經常被作為污染的指示生物，用于海洋環境監測； 同時，雙殼貝類味道鮮美，是主要的海產品，貝類攜帶的微塑料極易進入人體內。盡管到目前為止，攝入的微塑料對生物和人體的影響尚不明確，但研究生物體內微塑料的分布情況對正確評價其影響有重要意義，因而調查監測市售貝類產品微塑料含量，保證海產品安全，具有一定的研究意義和實際價值。目前，國內已經有針對市售貝類整體軟組織中微塑料含量的調查[14，15]，但是探究多種貝類消化系統中微塑料含量的研究較少，且樣品的處理方法還有待改進，而雙殼貝類的消化系統組織是微塑料的高密度聚集區，因此檢測雙殼貝類消化系統中的微塑料可以反映整個貝類軟組織中微塑料的含量，具有一定的科學意義。

生物樣品中分離微塑料的關鍵在于有效的消解有機質，且不影響微塑料的定性與定量分析。目前，應用于生物樣品預處理的方法主要有：酸性消解、堿性消解及酶消解[16]。酸性消解在消解生物樣品的同時也會消解部分類型的微塑料[16]，如van Cauwenberghe等[17]使用69% HNO3溶液分離貽貝體內的微塑料，檢出微塑料的豐度僅有0.36 個/g，并且沒有觀察到纖維狀的微塑料； Catarino等[18]發現使用HNO3溶液過夜消解后，尼龍纖維類的微塑料消失。堿性消解需控制合適的堿濃度，既能消解有機質，而且不影響微塑料的定性與定量分析，如Cole等[19]發現1 mol/L NaOH在室溫條件下對海水中浮游生物的消解率可達90%，但當NaOH濃度達到10 mol/L時，會損壞部分微塑料。酶消解的成本較高，使用較少。分離收集的微塑料需進一步通過鑒定，以明確微塑料的成分。目前微塑料的鑒定方法有：高溫裂解氣相色譜/質譜法、拉曼光譜法、傅立葉變換紅外光譜法。 前兩種方法鑒定微塑料成分時，容易受到塑料添加劑以及其它污染物的影響，并且高溫裂解氣相色譜/質譜法進行微塑料鑒定分析時，會完全破壞樣品，造成樣品的不可回收。傅里葉變換紅外光譜法是目前較為通用的方法，這種方法分析樣品前只需將樣品進行干燥處理[1]。

本研究選取青島市5個大型水產品市場中的雙殼貝類及黃島區野生紫貽貝為調查對象，建立了分離貝類消化系統中微塑料的前處理技術，初步調研了市售櫛孔扇貝（Chlamys farreri）和紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）消化系統中微塑料的累積情況，并與野生紫貽貝消化系統中的微塑料進行對比，為青島沿岸水域的微塑料污染及生態風險方面的調查研究提供了一定的方法學參考以及環境評估信息。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Nicolet iN 10MX傅里葉變換顯微紅外光譜儀（Thermo公司）； 尼康SMZ1270型體視顯微鏡（南京衡橋儀器有限公司）；ZQLY-180S型振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）； FSH-2A可調高速勻漿機（金壇市城西崢嶸實驗儀器廠）； KQ-400KDE型高功率數控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-ⅢA循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）； 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）； Milli-Q超純水（18.2 MΩ cm）處理系統（美國Millipore公司）； ME104/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

PP、PE、PS、PVC微塑料標準品（粒徑 50 μm，上海陽勵機電科技有限公司）； KOH、 30% H2O2（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）； 玻璃纖維素濾膜（Whatman GF/F）。

2.2 微塑料回收實驗

為了考察方法的準確度，在實驗室中分別取15個較肥和較瘦弱的紫貽貝的消化系統部分，勻漿混勻后作為消解基質，并以10% KOH溶液與30% H2O2溶液為消解體系， 對樣品進行處理。選取粒徑為50 μm的海洋環境中常見的4種材質的微塑料標準品（PP、PE、PS、PVC）進行加標回收實驗，每組做3個重復，同時每個消解體系做3個空白對照。具體步驟如下：（1）準確稱取0.50 g勻漿后的消化系統組織和0.1000 g微塑料標準品于250 mL錐形瓶中。 （2）每個錐形瓶中加入50 mL 10% KOH溶液或30% H2O2溶液后密封。（3）超聲5 min完全混勻后，將錐形瓶放入60℃、90 r/min的振蕩培養箱中消解有機質。（4）消解24 h后，立即將消解后的溶液抽濾至已稱重的玻璃纖維濾膜上（直徑為47 mm，孔徑為0.7 μm）。（5）將濾膜暫放于玻璃培養皿中，于50℃的烘箱中干燥后稱重，計算回收率。

2.3 雙殼貝類樣品采集及微塑料的分離

養殖的櫛孔扇貝和紫貽貝購于青島市區的5個大型水產品批發市場（2017年春季），野生紫貽貝采集于青島市黃島區的巖石海岸帶（2017年春季）。生物樣品采集完畢后，立即帶回實驗室，測量其體長、體重并記錄，于20℃下冷凍保存至分析。

解剖取單個貝類消化系統部分，貝類的消化系統由消化道及消化腺組成，解剖時應避免誤取其它組織。取出貝類消化系統組織稱重后置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 10% KOH溶液后密封。超聲5 min后，將錐形瓶置于振蕩培養箱消解24 h。樣品消解完成后，立即將消解后的溶液抽濾至玻璃纖維濾膜上。濾膜置于玻璃培養皿中，于50℃的烘箱中干燥待測。

每次實驗時做一個空白對照， 以除去實驗室環境對樣品的沾污，實驗過程中應避免接觸纖維類以及塑料器材。另外，所有使用的玻璃容器均用超純水沖洗3次。對于非使用中的樣品及溶液，應覆蓋避免沾污。

2.4 微塑料樣品的定量與定性分析

將富集微塑料的濾膜放置在體視顯微鏡下對微塑料進行觀察（放大20～80倍），將微塑料顆粒以及疑似為微塑料的顆粒進行記錄，并用尼康Ds-Ri2照相系統拍攝微塑料照片。獲得的微塑料及疑似微塑料的顆粒利用傅里葉變換顯微紅外光譜儀進行成分分析，確定聚合物的類型。紅外光譜儀選用透射模式，光譜范圍設定為4000～675 cm1，樣品采集時間為3 s，每次測量共進行16次掃描，光譜分辨率設置為8 cm1。光闌大小視樣品中微塑料的具體尺寸確定。最后，將微塑料光譜圖與OMNIC picta軟件中的譜庫進行檢索對比，結合官能團的特征峰以確定聚合物的類型。

3 結果與討論

3.1 方法學考察結果

對10% KOH和30% H2O2溶液消解0.50 g消化系統組織的結果進行比較。結果表明，消解24 h后，10% KOH溶液可完全消解，溶液中無固體有機質的存在，剩余有機質的質量僅為0.0033 g，殘余量為6.6‰； 30% H2O2溶液消解有機質24 h后，溶液中仍有少量白色固體有機質，剩余有機質的質量為0.0155 g，殘余量為3.1%，兩者在統計學分析上存在極顯著差異（p<0.01）。

通過計算回收率發現，以10% KOH溶液為消解體系，PP、PE、PS和PVC標準品回收率的范圍為96.7%～98.6%（PP>PE>PS>PVC）； 以30% H2O2溶液為消解體系，PP、PE、PS和PVC標準品回收率的范圍為93.7%～97.6%（PS>PP>PE>PVC）。不同消解體系，4種微塑料標準品的回收率均表現為10% KOH>30% H2O2，其中，PS標準品的回收率在兩種消解體系中差異不明顯。實驗結果表明，以10% KOH溶液作為消解體系， 4種材質的微塑料回收精密度較好（RSD≤3.2%），說明測定結果具有良好的重現性和準確度。加標回收率及精密度實驗結果見表1。

3.2 生物樣品的形態學特征

測量了采集的貝類的殼長、帶殼濕重以及消化系統組織的濕重，結果見表2。不同市區同一物種的形態學特征差距不明顯，但同一市區不同物種形態學特征差距較大，其中，同一市區的貝類消化系統組織濕重的比較：市售櫛孔扇貝>市售紫貽貝>野生紫貽貝。

3.3 生物中微塑料的含量及分布特征

3.3.1 貝類中的個體微塑料檢出率 貝類（2種）消化系統中的微塑料檢測結果顯示（表2）： S1和S5市售紫貽貝的個體微塑料檢出率達到100%，其它3區均為90%； S1、S2及S4的市售櫛孔扇貝的個體微塑料檢出率為90%，而S3的個體微塑料檢出率是100%，S5較其它地點低，個體微塑料檢出率為80%。野生紫貽貝的個體微塑料檢出率只有40%。由此可見，養殖貝類中的個體微塑料檢出率高于野生貝類中的個體微塑料檢出率。

3.3.2 貝類中微塑料的豐度分布 在貝類樣品中，市售櫛孔扇貝消化系統中微塑料的平均豐度為5.2～19.4個/個體和3.2～7.1個/g，市售紫貽貝的平均豐度范圍為1.9～9.6個/個體和2.0～12.8 個/g （圖1），與Li等[15]檢測的紫貽貝整個軟組織中的微塑料平均豐度相差不大。其中，S1的紫貽貝消化系統組織中微塑料的平均豐度（9.6個/個體，12.8 個/g）在5個市區的紫貽貝中均表現為最高，這與貝類生長區環境污染嚴重密切相關。本研究為了排除空氣中微塑料的污染，每次實驗設置一組空白對照，結果表明，空白組的微塑料含量只有（0.67±0.58）個/濾膜，并且在統計結果中均已扣除了背景值。

本研究發現，市售紫貽貝消化系統中微塑料的平均豐度（1.9個/個體，3.17 個/g）高于野生紫貽貝消化系統中微塑料的平均豐度（0.53個/個體，2.0個/g），兩者體內微塑料積累量差異顯著，這與Mathalon等的研究結果一致[20]。這可能與養殖紫貽貝附著在聚丙烯塑料線上生長有關，養殖水域內可能含有較短、老化的聚丙烯塑料線，增加了養殖紫貽貝誤食的幾率。而Li等[15]的研究指出野生紫貽貝體內微塑料的含量高于養殖紫貽貝體內微塑料的含量。文獻[21，22]的結果表明， 養殖紫貽貝與野生紫貽貝體內微塑料含量差異不明顯。可見，不同地區紫貽貝中微塑料含量差異大，這可能與不同地區受微塑料污染的程度大小相關。

3.3.3 貝類中不同形狀微塑料的含量 貝類樣品中存在纖維、碎片和顆粒3種不同形狀的微塑料，其含量高低順序為纖維狀>碎片狀>顆粒狀，分別占微塑料總數的84.11%、14.94%和0.95%。其中，顆粒狀微塑料僅在S3和S5市售櫛孔扇貝中檢出，且數量較少，S2和S3市售紫貽貝中檢出碎片狀的微塑料數量較其它市區偏高（表3）。由此說明，不同市區的微塑料污染情況具有較大的空間差異性。

3.4 貝類中微塑料的顏色及粒徑特征

3.4.1 貝類中微塑料的顏色特征 貝類樣品中檢出的微塑料有多種顏色。其中，纖維狀的多為黑色和藍色，也有少量為綠色（圖2A～2C）。碎片狀的微塑料以透明和紅色為主（圖2D～2F）； 顆粒類的微塑料多為白色的小球（圖2G）。

3.4.2 貝類中微塑料的粒徑特征 貝類消化系統中檢出的微塑料的粒徑范圍是在25 μm～5 mm。其中，粒徑小于500 μm的微塑料占26%～84%， 500～1000 μm之間的微塑料占13%～53%，>1 mm的微塑料占3%～42%（圖3）。不同市區貝類中的微塑料隨著粒徑增大，數量呈現遞減的總體趨勢。

本實驗中在測量不同形狀微塑料的粒徑時，纖維狀的微塑料是對其實際長度進行的測量，碎片狀和顆粒狀的微塑料則通過測量其最長長度作為微塑料的粒徑。通過統計發現，不同形狀的微塑料粒徑分布也有所差異。纖維狀微塑料的平均粒徑最大，達到（0.66±0.70） mm； 其次是碎片狀微塑料，平均粒徑為（0.39±0.50） mm； 顆粒狀微塑料的平均粒徑最小，為（0.25±0.11）mm（圖4A）。另外，不同市區的纖維狀微塑料的平均粒徑均最大，碎片狀微塑料的平均粒徑空間差異性較大（圖4B）。可見，微塑料粒徑的大小差距較大且受空間差異的影響，可能與貝類生長區塑料不同的碎化程度有關。

3.5 貝類中微塑料的聚合物類型

通過μ-FT-IR 鑒定貝類中微塑料聚合物的成分，發現貝類中豐度最高的微塑料成分是賽璐玢（CP）（圖5A），其次是聚丙烯（PP）（圖5B）、聚四氟乙烯（PTFE）等。樣品中大部分纖維狀的微塑料為賽璐玢，少量碎片狀的微塑料也為賽璐玢。賽璐玢是一種再生纖維素薄膜，具有較低的生物降解性。許多塑料被貼上“可生物降解”的標簽，但只有溫度達到50℃才會完全分解，可生物降解塑料似乎是解決海洋塑料垃圾問題的“虛假解決方案”[23]。文獻[23～25]中均將賽璐玢定義為微塑料。本研究也將賽璐玢認定為微塑料。另外，本研究在養殖紫貽貝消化系統中檢測出聚丙烯塑料線，而在野生紫貽貝消化系統中檢出的微塑料多為纖維狀的賽璐玢。由此說明，養殖與野生貝類體內的微塑料含量與其所在的環境密切相關，可通過檢測貝類體內微塑料的類型，側面評估養殖水域的微塑料污染情況。

4 結 論

采用KOH消解體系對貝類消化系統組織進行消解，不但消解徹底、節省了樣品前處理時間，而且加標微塑料回收率高。結果表明，市售貝類消化系統中微塑料的豐度較高，并且微塑料的形狀和粒徑分布具有較大的空間差異性。另外，本研究發現市售貝類消化系統中微塑料的個體檢出率高于野生貝類中的個體微塑料檢出率，并且貝類消化系統中的微塑料的類型及含量與環境中的微塑料分布密切相關。本研究結果可為海洋環境微塑料污染狀況評價及海產品安全控制等提供技術支撐。

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