頂空氣相色譜法同時測定新藥CBT108中12種殘留溶劑

胡美晨 黃金文 黃磊磊 謝達 朱陽斌 王琳 王天興 吳范宏

摘 要 采用頂空氣相色譜技術，建立了同時測定新藥CBT108中12種殘留溶劑的方法。優化了平衡加熱時間和程序升溫時間以及制樣的溶劑，并通過驗證確定了本方法的合理性、準確性和可行性。在優化的實驗條件下，采用DB-624型毛細管柱（6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液，30 m×0.53 mm×3.0 μm）分離、氫火焰離子化檢測器檢測、內標法定量的分析方案，實現了甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、庚烷、甲苯和四氯化碳共12種殘留溶劑的同時分離與測定。12種溶劑在各自的范圍內線性關系良好，線性相關系數（R2）均>0.997； 以10倍信噪比確定方法定量限，以3倍信噪比確定方法檢出限，分別為：甲醇0.024 μg/mL、0.0072 μg/mL； 乙醇0.1 μg/mL、0.012 μg/mL； 乙醚0.01 μg/mL、0.005 μg/mL； 丙酮0.1 μg/mL、0.008 μg/mL； 乙腈1.025 μg/mL、0.0615 μg/mL； 二氯甲烷0.09 μg/mL、0.06 μg/mL； 正己烷0.0174 μg/mL、0.0145 μg/mL； 乙酸乙酯0.25 μg/mL、0.008 μg/mL； 四氫呋喃0.108 μg/mL、 0.014 μg/mL； 四氯化碳0.16 μg/mL、0.0004 μg/mL； 庚烷0.0075 μg/mL、0.005 μg/mL； 甲苯0.0445 μg/mL、0.0014 μg/mL。在3個添加水平下，12種殘留溶劑的加標回收率在90.96%～108.67%之間，相對標準偏差為0.1%～5.7%。結果表明，本法簡單、快速、重現性好、準確性高，可用于實際藥品中以上12種殘留溶劑的檢測， 并可對其它藥物中殘留溶劑的檢測提供參考。

關鍵詞 頂空氣相色譜法；殘留溶劑；新藥CBT108；同時測定

1 引 言

在藥物合成反應中不可避免地會使用有機溶劑[1，2]，但是溶劑副產物殘留高于安全值時，會產生毒性和致癌作用[3，4]。國際人用藥品注冊技術協會（International Conference for Harmonization， ICH）要求所有藥品均需經過殘留溶劑的檢測與控制[1]。各國藥典對藥品中殘留溶劑法規的制定均參考ICH頒布的指導原則，依據PDE將殘留溶劑劃分為四類總計69種[5～7]，并規定第一、二、三類殘留溶劑不得高于藥典規定的限量，第四類應根據生產工藝特點制定相應限量以滿足GMP要求[8]。基于新的毒理學研究結果，ICH 在2002年修訂了四氫呋喃和N-甲基吡咯烷酮的PDE，并將四氫呋喃由三類溶劑改為二類溶劑。2011年BP將環氧乙烷和二氧六烷不再作為殘留溶劑項， 而另外作為一個測定項單獨列出[9]，即至今各國藥典對殘留溶劑的限度要求一致[10～12]。在檢測方法上，各國藥典均推薦采用氣相色譜法。BP采用AB雙系統進行測定，系統A主要用于定性分析，系統B用于定量分析； 計算方法上，ChP采用內標法和外標法兩種方式，USP和BP均只采用外標法[8，11，12]。本研究所涉及殘留溶劑均屬前三類。

目前，殘留溶劑的檢測方法有差示掃描量熱法[13]、紅外光譜法[14]、核磁共振[15]、氣相色譜法[16，17]等，這些方法除氣相色譜外，專屬性、靈敏度均不能達到ICH及各國藥典的要求。氣相色譜由于其高靈敏度、高分離能力，被各國推薦用于檢測藥物中殘留溶劑[18～21]。與直接進樣和動態頂空氣相色譜法相比，靜態頂空氣相色譜法更具優勢[3，18，19]。通過將樣品中殘留溶劑富集在頂空瓶上層氣體中達到氣-液或氣-固兩相平衡，直接定量取上層氣體進樣的方法，可使進樣室在較低溫度下操作，避免組分分解，減少難揮發物質對色譜系統與監測系統的干擾和污染，從而使分析過程更加簡便、快速、靈敏，提高分析結果的準確度與可重現性，目前已成為殘留溶劑檢測的首選方法[2，22，23]。新藥CBT108為上海華理生物醫藥有限公司與浙江野風藥業有限公司聯合開發的腫瘤血管靶向性抗腫瘤藥物，目前已啟動臨床I期研究，其合成涉及到的殘留溶劑有12種，分別為甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、庚烷、甲苯、四氯化碳。本研究采用靜態頂空氣相色譜法， 內標法定量，考察了不同固定相、平衡加熱時間、升溫程序和制樣溶劑的影響，建立了同時測定新藥CBT108中12種殘留溶劑的新方法。本方法快速、準確，也可作為其它藥物檢測殘留溶劑的方法依據和技術基礎。

2 實驗部分

2.1 儀器及試劑

Agilent Technology GC7890A system氣相色譜儀，配有氫火焰離子化檢測器（FID）以及Agilent Technologies G1888型頂空自動進樣器（美國Agilent公司）； QPH-300II型氫氣發生器（上海全浦科學儀器有限公司）； SGK-2LB低噪音空氣泵（北京東方精華苑科技有限公司）；Metller Toledo XS105分析天平（瑞士Metller公司）； 20 mL頂空進樣瓶。

甲醇（純度99.9%）、乙醇（純度99.8%）、乙醚（純度99.7%）、丙酮（純度99.5%）、乙腈（純度99.9%）、二氯甲烷（純度99.5%）、正己烷（純度98%）、正丙醇（純度99.5%）、乙酸乙酯（純度99.5%）、四氫呋喃（純度99.9%）、庚烷（純度99%）、甲苯（純度99.9%）均購于美國Dedia公司； 四氯化碳（純度99.5%，天津市四有精細化學品有限公司）。實驗樣品為上海華理生物醫藥有限公司生產的CBT108。

2.2 色譜條件

6 %氰丙基苯基-94 %二甲基聚硅氧烷毛細管柱（DB624， 30 m×0.53 mm×3.0 μm； Serial No.： US8989746H）。程序升溫：初始溫度40℃保持5 min，以10℃的速率升溫至260℃，保存3 min；載氣為氮氣；FID檢測器， 溫度： 300℃；進樣口溫度： 220℃； 分流比：25∶1； 柱流速：3.0 mL/min； 頂空平衡溫度85℃，平衡時間40 min；定量環溫度100℃；傳輸管溫度110℃；進樣量：1 mL。

2.3 溶液的配制

2.3.1 溶劑及內標溶液 溶劑為50 % （V/V） N，N-二甲基甲酰胺（DMF）-水， 內標溶液：取正丙醇適量，加溶劑稀釋制成50 μg/mL的溶液，作為內標溶液。

2.3.2 對照品溶液 分別精確稱取四氯化碳4 mg，用內標溶液溶解并稀釋定容至100.0 mL； 使四氯化碳濃度為40 μg/mL； 準確移取甲醇30 mg、乙醇50 mg、乙醚50 mg、丙酮50 mg、乙腈4.1 mg、二氯甲烷6 mg、正己烷2.9 mg、乙酸乙酯50 mg、四氫呋喃7.2 mg、庚烷50 mg、甲苯8.9 mg和上述濃度為40 μg/mL四氯化碳溶液1.00 mL，用內標溶液稀釋并定容至100.0 mL； 各有機溶劑的終濃度分別為：甲醇300 μg/mL， 乙醇500 μg/mL， 乙醚500 μg/mL， 丙酮500 μg/mL， 乙腈 41 μg/mL，二氯甲烷60 μg/mL， 正己烷29 μg/mL，乙酸乙酯500 μg/mL，四氫呋喃72 μg/mL，四氯化碳0.4 μg/mL，庚烷的濃度500 μg/mL， 甲苯89 μg/mL，作為對照品溶液。

3 結果與討論

3.1 系統適應性與方法專屬性

取內標溶液10 mL置于20 mL頂空瓶中，密封瓶口，作為空白試驗溶液定量進樣1 mL； 另取甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、四氯化碳、庚烷、甲苯各l μL置于20 mL頂空瓶中，分別進樣，通過測定單一溶劑的保留時間確定混合溶劑樣品各個峰的歸屬。另取對照品溶液10.00 mL至頂空瓶中，按擬定色譜條件連續進樣5次，計算出甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、四氯化碳、庚烷、甲苯的理論塔板數均>5000、分離度均>1.5，各峰面積校正值的RSD在0.3%～3.0%之間，符合藥典規定各組分理論塔板數應>5000，分離度不小于1.5，峰面積校正值≤10%的標準[8]，對照品分離色譜圖見圖1， 系統適應性及專屬性良好。

3.2 線性關系、定量限及檢出限

分別取混合對照品溶液1 mL，用內標溶液稀釋定容至100 mL，然后分別稀釋成濃度為甲醇0.024～600 μg/mL、乙醇0.1～1000 μg/mL、乙醚0.01～1000 μg/mL、丙酮0.1～1000 μg/mL、乙腈1.025～82 μg/mL、二氯甲烷0.09～120 μg/mL、正己烷0.0174～58 μg/mL、乙酸乙酯0.25～1000 μg/mL、四氫呋喃0.108～144 μg/mL、四氯化碳0.16～0.8 μg/mL、庚烷0.0075～600 μg/mL、甲苯0.0445～178 μg/mL的系列標準工作溶液。按上述色譜條件進樣測定，以峰面積校正值（Y）對相應溶劑的質量濃度（X， μg/mL）繪制標準曲線。12種殘留溶劑在各自的濃度范圍內線性關系良好。以S/N=3計算檢出限（LOD），以S/N=10計算定量限（LOQ），結果列于表1。

3.3 回收率

根據《中華人民共和國藥典》2015年版第四部0861殘留溶劑測定法中的規定，12種溶劑的殘留限度值分別為：甲醇0.3%、乙醇0.5%、乙醚0.5%、丙酮0.5%、乙腈0.041%、二氯甲烷0.06%、正己烷0.029%、乙酸乙酯0.5%、四氫呋喃0.072%、四氯化碳0.0004%、庚烷0.5%、甲苯0.089%[8]。取9個20 mL的頂空瓶，分別加入CBT108樣品1.0 g，移取對照品溶液濃度的80%、100%和120%各3份至頂空瓶中，分別進行測定。測定結果如表2所示，藥典規定待測物的回收率應在90%～110%之間，樣品測定結果均在此范圍內，可滿足實際分析要求。

3.4 精密度

3.4.1 重復性 取混合對照品溶液10 mL置于20 mL頂空瓶中，密封瓶口，制備6份。按照上述色譜條件，連續注入氣相色譜儀，記錄峰面積校正值及相對標準偏差，各組分RSD（n=6）分別為：甲醇0.8%、乙醇0.3%、乙醚2.0%、丙酮0.9%、乙腈0.6%、二氯甲烷1.8%、正己烷2.6%、乙酸乙酯1.1%、四氫呋喃1.0%、庚烷3.0%、甲苯1.4%、四氯化碳2.5%。藥典規定待測組分含量0.01%以內的重復性RSD可接受范圍為4%，上述檢測結果表明各溶劑的檢測重復性良好。

3.4.2 重現性 取混合對照品溶液10 mL置于20 mL頂空瓶中，密封瓶口，制備6份。分別按照上述色譜條件，連續注入氣相色譜儀，由另一名分析人員在不同實驗室進行測定，記錄12份樣品中的峰面積校正值及相對標準偏差。檢測各組分RSD（n=12）分別為：甲醇1.2%、乙醇0.7%、乙醚2.2%、丙酮1.1%、乙腈1.0%、二氯甲烷2.0%、正己烷2.5%、乙酸乙酯1.3%、四氫呋喃1.2%、庚烷2.8%、甲苯1.9%、四氯化碳5.5%。藥典規定待測組分含量0.01%以內的重現性RSD可接受范圍為8%，檢測結果表明各溶劑的檢測重現性良好。

3.5 分析條件的優化

3.5.1 色譜柱的選擇 不同極性的固定相影響待測組分的保留時間、峰形、對稱度等重要色譜參數，待測組分的沸點差異也是選擇合適固定相的重要影響因素，待分離的12種組分包括極性與非極性溶劑，其中甲醇、丙酮、乙腈極性較大、沸點相似； 使用極性毛細管柱則易導致強極性組分保留時間短、分離不好，且強極性溶劑N，N-二甲基甲酰胺易干擾極性大的組分出峰； 使用非極性毛細管柱雖可減少極性影響但三者沸點相似易導致分離不好。綜合考慮上述因素，選擇對12種殘留溶劑、內標物與N，N-二甲基甲酰胺均分離較好的中極性色譜柱DB-624作為本研究的分析柱。

3.5.2 頂空平衡溫度及時間的選擇 頂空平衡溫度過低會影響氣-液兩相的平衡，過高則會導致組分結構被破壞、溶劑大量蒸發，影響結果準確性。待測溶劑的沸點在34.6～154℃之間，藥典規定頂空平衡溫度一般應低于溶解供試品所用溶劑的沸點10℃以下，且應兼顧待測組分的沸點，避免供試品熱分解，故選擇頂空平衡溫度為85℃； 另外，頂空平衡時間過短會使氣-液兩相不夠達到足夠的平衡，反之會影響頂空瓶的氣密性、降低定量的準確性，故選擇平衡時間為40 min； 為防止高沸點組分在傳輸過程中冷凝，選擇提高定量環溫度為100℃，傳輸管溫度為110℃。

3.5.3 程序升溫與分流比的選擇 由于乙醚、丙酮和三氯甲烷沸點較低，故選擇40℃為起始柱溫，為了防止過低的溫度導致峰形擴張，出現拖尾，選擇將最終柱溫適當升高以滿足分析要求，綜合各方面因素，升溫程序調整為40℃，保持5 min，以10℃/min升溫到260℃，保持3 min，同時為了減輕色譜柱負荷提高檢測器靈敏度，將分流比調整為25∶1。

3.5.4 溶劑的選擇 DMF、DMSO等有機溶劑沸點較高，用頂空時容易殘留，干擾檢測，另考慮到減少有機組分在有機溶劑中的溶解度，增加其在頂空氣體中的含量，使兩相更快平衡，選擇DMF和水組成的二元溶劑系統作為溶劑。

3.6 實際樣品分析

采用本方法對3批CBT108樣品進行了分析。在定量分析時，依據實際峰面積，采用內標法進行分析，結果列于表3。樣品中可檢出甲醇、乙醇和二氯甲烷，但都低于《中華人民共和國藥典》的殘留溶劑限度值，其余溶劑均未檢出。

4 結 論

建立了新藥CBT108中12種殘留溶劑的分析方法，考察了固定相、平衡時間、升溫程序和溶劑對組分的分離影響，并驗證了方法的可靠性與準確性。本方法不僅可用于CBT108殘留溶劑的檢測，也可作為檢測其它眾多藥物殘留溶劑的方法依據和技術基礎，具有良好的實際應用與參考價值。

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