溫度和多胺對柑橘潰瘍病發生的影響及作用機制

楊楓，陳傳武，范七君，石春梅，謝宗周，郭大勇，劉繼紅

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溫度和多胺對柑橘潰瘍病發生的影響及作用機制

楊楓1，陳傳武2，范七君2，石春梅1，謝宗周1，郭大勇1，劉繼紅1

（1華中農業大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室，武漢 430070；2廣西特色作物研究院/廣西柑橘生物學重點實驗室，廣西桂林 541004）

【目的】潰瘍病是嚴重危害柑橘的一種細菌性病害，通常在高溫下容易發生。論文旨在闡明高溫下柑橘易發生潰瘍病的機制，揭示其代謝變化，為利用藥劑防治潰瘍病提供重要的理論指導。【方法】以感病的甜橙（）為研究對象，在21℃和30℃下預培養3 d，然后均接種同樣濃度（108cfu/ml）的柑橘潰瘍病菌（subsp.，）10 μl，比較兩組植株的發病率，采用半定量RT-PCR分析兩種溫度下4個抗病基因、、和的表達量，利用HPLC測定預培養3 d后葉片內源多胺（腐胺、亞精胺和精胺）的含量。在此基礎上，利用外源亞精胺（0.4 mmol·L-1）處理甜橙植株（以清水處理為對照），比較亞精胺和清水處理的植株接種潰瘍病菌后的發病率和病情指數，分析亞精胺處理對內源多胺含量和抗病基因、、和表達的影響。【結果】潰瘍病菌接種后觀察發現，21℃培養植株潰瘍病的發病率在前期低于30℃培養的植株，至第10天時，兩個處理組植株的發病率接近；同時HPLC測定發現，21℃培養植株葉片3種自由態多胺（腐胺、亞精胺和精胺）含量高于30℃培養植株；RT-PCR分析表明，、和這3個抗病基因的表達量在21℃培養植株中高于30℃培養植株，而表達水平在兩組材料中差異不明顯。外源亞精胺處理顯著增加了內源腐胺和亞精胺的含量，降低了所處理植株接種潰瘍病菌后的發病率和病情指數,接種后14 d發病率比對照降低45%，病情指數比對照降低4.8，而由表型可見對照發病程度重于亞精胺處理材料。此外，亞精胺處理能夠增強、、和4個抗病基因的表達量。【結論】高溫下甜橙更易發生潰瘍病的可能機制是高溫抑制抗病基因的表達和多胺合成。外源多胺處理能夠降低甜橙發生潰瘍病，可能機制是多胺處理后增強了抗病基因的表達，誘發植株的抗病反應最終表現出抗病。因此，高溫是影響潰瘍病發生的一個關鍵環境因子，多胺有助于提高對柑橘潰瘍病的抗性。

柑橘；潰瘍病；高溫；多胺；抗病基因；抗病性

0 引言

【研究意義】細菌性潰瘍病（bacterial canker disease，BCD）是嚴重危害柑橘的一種病害，在世界范圍內對柑橘產業造成了大的損失，被列入檢疫性病害，其病原為柑橘黃單胞菌柑橘亞種（subsp.，）[1]。可侵染柑橘葉片、皮刺、枝條及果實，造成落葉、梢枯、削弱樹勢等危害，嚴重時還引起落果。由于細菌性潰瘍病對于柑橘樹體正常生長和果實產量及品質均有重要的影響，培育抗潰瘍病的柑橘品種或采取有效的防病措施對于柑橘產業持續、健康發展具有重要意義。【前人研究進展】目前，從寄主角度針對柑橘潰瘍病開展的工作主要包括以下幾個方面：分析不同柑橘品種或資源對的抗性差異[2]、克隆和鑒定抗病基因[3-5]、解析柑橘對應答的生理或分子機制[6]、柑橘遺傳轉化和轉基因植株抗性評價[7-9]、外源藥劑（如水楊酸）防控強潰瘍病等[10]，對揭示柑橘抗病性差異的生理和分子機制、發掘和創制抗性資源等起到了重要的作用。柑橘基因型是影響潰瘍病發生程度的一個重要因素，大多數柑橘栽培品種均易發生潰瘍病，而金柑和枸櫞C-05（）則較少發病，后者更是被認為對柑橘潰瘍病具有免疫抗性[2,6]。對抗病和感病的柑橘資源進行分析，發現葉片結構、氣孔大小與密度、葉片分泌物質、抗氧化酶活性及基因表達譜等與潰瘍病抗性強弱有關[2,6,10]。如有報道表明氣孔小可能是金柑抗病的一個的結構機制，能夠限制進入葉片的細菌數量[6]；枸櫞C-05葉片分泌特殊的物質抑制潰瘍病菌生長，使其表現出較好的抗性[2]。植物在遭受病原入侵時，會主動合成一些物質去增強抗病性。研究表明，在抗病中起作用的次生代謝物較多，多胺是其中一種。多胺是廣泛存在于活體生物中的一類低分子量含氮脂肪堿，具有多聚陽離子特性，在生理pH下帶正電荷，能夠共價結合帶負電荷的大分子物質（如DNA、RNA、染色質和蛋白質等），因而參與了許多植物生理和生物學過程[11-12]。高等植物中常見的多胺為腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，Spd）和精胺（spermine，Spm）。此外，多胺還被認為具有清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）、調節滲透壓的作用[11]。基于多胺這些特性，大量研究認為，多胺是植物應答非生物脅迫的一類重要代謝物[12]。研究還表明，多胺在植物應答生物脅迫中也發揮著重要的作用[13-14]，這主要是基于以下研究結果：（1）植物在病原菌入侵時，多胺合成酶活性上升，使體內積累多胺[15]。如大麥在接種白粉病菌（）后，鳥胺酸脫羧酶活性顯著增加，葉片中自由態Spd、共軛態Spd和Put含量升高[16]。對煙草接種活體營養型細菌后發現，植株體內Spm顯著增加[17]。這些結果說明多胺參與寄主植物的病原應答過程；（2）外源施用多胺能增強植物的抗病能力，如外源添加Spm增強了煙草對煙草花葉病毒（，TMV）的抗性[18]；（3）超表達多胺合成基因，使轉基因植株中的多胺含量增加，其抗病性也得以增強[9]。【本研究切入點】無論是開展抗病育種還是研發潰瘍病防控技術，理論上均需要對柑橘應答的侵染進行深入地研究。柑橘潰瘍病在高溫環境下容易發生，但這一現象的機制卻知之甚少。此外，利用外源多胺防控潰瘍病發生的研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】以冰糖橙（）為供試材料，比較不同溫度下植株接種潰瘍病菌后的發病情況、多胺含量及抗病基因的表達，同時分析外源多胺處理能否增強抗病能力。闡明高溫下柑橘易發潰瘍病的可能機制，同時為研發和應用基于外源物質處理增強抗病性的技術提供理論指導。

1 材料與方法

試驗于2014年在華中農業大學園藝林學學院和廣西特色作物研究院完成。

1.1 植物材料和菌株

植物材料為三年生冰糖橙植株，接種用的柑橘潰瘍病菌株由華中農業大學植物病理實驗室洪霓教授提供。病菌在SPA培養基（蔗糖20 g，蛋白胨5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，pH 7.2—7.4）中懸浮培養，接種試驗在廣西特色作物研究院進行。

1.2 處理

選取葉齡為30—45 d、部位相同且長勢良好的夏稍枝條，田間取回后迅速將枝條下端插入清水中，分為兩組，分別放置于21℃和30℃光照培養箱中，72 h后用于接種，在溫度處理結束后取葉片用于多胺含量測定和抗病基因表達分析。此外，為研究多胺是否有利于增強潰瘍病抗性，將冰糖橙植株分別用清水或0.4 mmol·L-1亞精胺（Spd）溶液每24 h噴施葉面一次，連續處理72 h。Spd處理結束后取葉片測定內源多胺含量（所取葉片先經清水洗凈擦干），同時將處理的葉片接種。為分析抗病基因表達，將Spd噴施葉片3 d和7 d，取處理前和處理后的葉片用于抗病基因表達分析。

1.3 Xcc接種

參考Wang等[6]針刺接種法，將需要接種的葉片用清水洗凈擦干，在葉脈兩側相同部位用接種針各刺5個傷口，在每個傷口周圍分別再刺5個小傷口。隨后用移液槍吸取配置好的菌液10 μl（濃度約為108cfu/ml）打在傷口上。將接種后的葉片套上塑料袋，放置于28℃條件下培養，在接種后不同時間（溫度處理材料在接種后第3、7、10天；多胺處理材料在接種后第7、10、14天）統計發病率與病情指數。每個處理組各統計50個病斑，分析軟件為ImageJ（NIH）。

1.4 多胺提取與測定

參考Zhang等[19]方法，將葉片在液氮中研磨成粉末，取0.1 g加入1 ml濃度為5%的高氯酸（perchloric acid，PCA），渦旋混勻后冰上放置30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，將上清液轉入一個新的離心管。沉淀中加入1 ml PCA，重復前面的步驟，離心后將兩次上清液合并（即為多胺粗提液）。取1 ml粗提液至10 ml離心管，加入50ml己二胺（1 mmol·L-1），加入1 ml的2 mol·L-1NaOH，渦旋混勻；加入10ml苯甲酰氯，渦旋20 s，37℃水浴20 min；加入2 ml飽和NaCl和2 ml乙醚，混勻后于8 000 r/min離心5 min；取1 ml乙醚相，真空濃縮干燥25 min；加200—500ml色譜級甲醇（Fisher，美國）溶解，0.22 μm有機濾膜過濾后取20ml在安裝紫外檢測器高效液相色譜系統（HPLC，Agilent 1200）中上樣。多胺檢測波長為230 nm，采用安捷倫C18反向色譜柱（4.6 mm×150 mm，孔徑5 μm）。洗脫液為色譜級甲醇∕水（A相/B相），采用梯度洗脫，流速0.7 ml·min-1，柱溫25℃。梯度洗脫程序見表1[20]。

1.5 RNA提取及RT-PCR

利用RNAiso Plus RNA試劑盒（TaKaRa公司）提取總RNA，總RNA使用DnaseI（TaKaRa）在37℃下去除DNA污染，然后采用ReverTra Ace-a-TM試劑盒（Toyobo，Japan）合成cDNA。使用Nanodrop 1000紫外分光光度計（Thermo Scientific）測定cDNA濃度，稀釋到200 ng·μl-1后用于RT-PCR。RT-PCR反應體系（25 μl）包括5×緩沖液2.5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1each）0.5 μL，MgCl2（1.5 mmol·L-1）1.5 μL，聚合酶1 μL，正向和反向引物各1 μL（終濃度為0.25 μmol·L-1，引物見表2），cDNA模板1 μL，加去離子水至25 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，共28個循環，72℃保溫10 min。用于表達分析的抗病相關基因有（chitinase）、（allene oxide synthase）、（glutathione peroxidase）和（pathogenesis-related protein 4A），以作為內參基因。

表1 自由態多胺分離所用HPLC洗脫程序

1.6 數據統計與分析

每個處理設置3個重復，數據采用Excel 2010作圖，通過Excel自帶軟件ANOVA（Analysis of Variance）進行差異顯著性分析（＜0.05）。

表2 本研究中RT-PCR分析所用引物序列

2 結果

2.1 不同溫度培養植株葉片發病情況

冰糖橙植株在21℃和30℃培養3 d后用于潰瘍病菌接種，在接種后第3、7和10天觀察兩個處理組植株的發病率。兩個處理組植株葉片在第3天均出現病斑，但二者的發病率卻存在差異。21℃條件下培養植株葉片在第3天的發病率為10%，而30℃條件下培養植株葉片的發病率接近40%。在第7天時兩組材料的發病率均有所增加，但30℃條件下培養植株的發病率更高。然而，在第10天時，兩個處理組植株的發病率接近（圖1）。

2.2 不同溫度處理后葉片多胺含量和抗病基因表達比較

多胺與植物的抗病能力有關[13-14]，因此，分析了21℃和30℃下培養3 d的冰糖橙植株自由態多胺含量。由圖2-A可見，兩組處理材料中均能成功地檢測到常見的3種自由態多胺，即腐胺（Put）、亞精胺（Spd）和精胺（Spm）。但21℃條件下預培養植株葉片自由態Put、Spd和Spm含量均高于30℃下培養植株，表明高溫條件下植株多胺合成減少。

圖1 21℃和30℃條件下預培養3 d的植株接種Xcc后的發病率

植物抗病性差異很大程度上與抗病基因表達有關[21-22]，因此，對21℃和30℃培養植株4個抗病基因、、和的表達進行分析。由圖2-B可以看出，除表達水平在兩組材料中差異不明顯外，其余3個基因的表達水平在30℃培養植株中均要低于21℃培養植株，表明高溫可能抑制了抗病基因的表達。

2.3 外源亞精胺處理后植株內源多胺含量及抗病基因表達變化

由圖2中可以看出，冰糖橙中Spd含量高于Put和Spm。因此，對冰糖橙植株外源施用Spd，以分析是否有利于增強抗病性。外源Spd處理3 d后，采集葉片分析游離態多胺含量（圖3-A）。可以看出，與對照（清水）處理相比，Spd處理材料中Put和Spd含量均明顯增加，但Spm含量差異不大。

Spd處理3 d后，、、和4個抗病基因的表達上調，其中和誘導最為強烈；在處理7 d后和表達水平達到最大值，而和的表達水平維持穩定（圖3-B）。

*表示兩種溫度下含量差異顯著（P＜0.05） * indicates siginificantly different of content between the two temperautres (P＜0.05)

圖3 外源亞精胺和清水處理后葉片自由態多胺含量（A）和抗病基因表達量（B）

2.4 外源亞精胺處理對潰瘍病抗性的影響

將清水或Spd處理葉片針刺接種，接種后觀察發病情況。由表型可見，接種后第7天時兩個處理組的葉片可以看到白色病斑，但Spd處理材料出現病斑的傷口明顯比對照組少或小；在第14天時對照發病程度重于Spd處理材料（圖4-A）。通過發病率比較也可以看出，在接種后14 d時Spd處理材料的發病率約為40%，而對照組在接種后14 d時的發病率為85%（圖4-B）。Spd處理組14 d時病情指數為4.2，但清水對照組在接種后第14天病情指數為9.0（圖4-C）。結果表明，外源Spd處理能夠增強冰糖橙葉片對柑橘潰瘍病的抗性。

圖4 外源Spd處理對潰瘍病抗性的影響

3 討論

植物對病原入侵的應答受多個因素影響，其中一個重要因素是溫度[23]。通常認為，適合生長的最佳溫度范圍為20—30℃，在此范圍里溫度增加則會加重潰瘍病發生[24]。本研究發現，在較高溫度下培養一段時間的植株對更敏感，表明高溫能促進寄主的發病或降低其抗病性，研究結果在一定程度上解釋了柑橘在高溫季節更容易感染潰瘍病的原因；另一方面也暗示，在高溫季節做好柑橘潰瘍病防治可能對于控制該病的發生和蔓延具有關鍵作用。

當病原入侵時，植物會啟動非病原特異性抗病反應，這是一種先天免疫特征，在感病或抗病植株、合適或不合適生長條件下均存在[25]。此過程中，植物在生理、代謝、細胞和分子水平上發生一系列的改變，包括代謝物的積累和基因表達的變化[21,26]。本研究發現，30℃條件下植株體內積累的多胺含量低于21℃條件下生長的植株；此外，還發現3個抗病基因表達水平在高溫下受到抑制。高溫下生長的植株易感染潰瘍病可能與其體內積累的代謝物（如本研究中的多胺）減少或抗病基因（如、和等）表達受抑制有關。高溫下多胺含量減少可能由于合成受阻所致，前期有研究表明，多胺合成關鍵基因（精氨酸脫羧酶）在高溫下表達下調，而多胺含量一定程度上取決于其合成基因在轉錄水平上的表達[11,27]。因此，高溫下多胺合成可能受到抑制，從而減少體內多胺含量。高溫下、和表達受抑制的原因尚不清楚，一個可能的機制是高溫抑制了調控上述3個抗病基因的轉錄激活因子或激活了某些轉錄抑制因子，使抗病基因的表達受到抑制，這一推論是否正確需要進一步證實。

本研究中，高溫下植株多胺含量減少，其潰瘍病抗性降低；相反，外源Spd處理提高了內源Spd含量，并增強了所處理植株的潰瘍病抗性，表明柑橘植株積累較高水平的多胺有利于提高其潰瘍病抗性。事實上，前期已有研究發現，超表達多胺合成基因提高了甜橙轉基因植株內源多胺含量，顯著增強了轉基因植株對潰瘍病的抗性[8]。多胺在抗病中的作用機制可能體現在如下兩個方面：（1）多胺作為信號分子參與抗病信號的傳遞[28-29]，但這一機制是否在潰瘍病抗性中發揮作用尚待證實；（2）多胺降解產生H2O2誘發抗病反應。研究表明，多胺合成后被轉運到質外體，進而由多胺氧化酶分解產生H2O2[30-31]，而H2O2是調節氣孔運動和引起過敏性反應（HR）的重要信號分子[32]。氣孔是潰瘍病菌進入植株體內的主要通道，當H2O2產生后能夠促進氣孔關閉，阻止潰瘍病菌通過氣孔進入體內[7]；此外，H2O2可以促進HR引起的細胞死亡從而將病原菌局限在接種部位。已有較多研究表明多胺分解形成的H2O2在植物防御病原入侵方面發揮著重要的作用[14,16,32-36]。因此，多胺更可能是通過產生H2O2來促進氣孔關閉或觸發局部HR來增強潰瘍病抗性。

病原入侵會產生相應的脅迫信號，植物感知和傳遞該信號并啟動相應的防御網絡，最終通過改變大量抗病基因的表達水平來應答病原入侵，暗示抗病基因的表達變化是植物-病原互作過程中一個極為重要的防御反應[22,26,37]。研究表明，PR蛋白是植物防御病原侵染最為重要的一類基因，通常被用作植物抗病反應的標記基因。CHI與PR4A分別是PR3和PR4類PR蛋白，在植物系統獲得性抗性中發揮著重要作用[38]。GPX參與細胞生化反應的多個過程，在保護寄主植物被病原入侵中也發揮關鍵作用[39]，AOS是茉莉酸合成的一種重要酶，而茉莉酸在植物防御反應中具有重要作用[40]。本研究中，發現兩種溫度下培養的植株雖然表達水平變化不大，但30℃下生長的植株、和表達水平明顯低于21℃下生長的植株。此外，外源Spd增強了潰瘍病抗性，與之一致的是4個基因的表達水平得以升高。可以清楚地看出，上述基因的表達水平與潰瘍病抗性呈正相關，表明它們在柑橘抗病反應中可能有重要的作用，是今后開展分子育種增強潰瘍病抗性的重要候選基因。

4 結論

高溫下甜橙更容易受柑橘潰瘍病菌危害，其可能的機制是高溫抑制抗病基因的表達和降低多胺的合成。外源多胺處理能夠增強甜橙潰瘍病抗性，可能原因是多胺處理后增強了抗病基因的表達，從而誘發植株的抗病反應最終表現出抗病。高溫是影響潰瘍病發生的一個關鍵環境因素，多胺有助于提高對柑橘潰瘍病的抗性。

[1] Das A K. Citrus canker-A review., 2003, 5(1): 52-60.

[2] 葛紅娟, 龍桂友, 戴素明, 李大志, 李娜, 鄧子牛. 冰糖橙與枸櫞C-05對潰瘍病菌生長特性的影響. 中國農業科學, 2015, 48(7): 1383-1391.

GE H J, LONG G Y, DAI S M, LI D Z, LI N, DENG Z N. The influence of ‘Bingtang’ sweet orange or citron C-05 on the growth characteristics ofpv.., 2015, 48(7): 1383-1391. (in Chinese)

[3] 周鵬飛, 賈瑞瑞, 陳善春, 許蘭珍, 彭愛紅, 雷天剛, 李強, 陳敏, 白曉晶, 鄒修平, 何永睿. 柑橘4個WRKY轉錄因子基因的克隆及其響應柑橘潰瘍病菌侵染的表達分析. 園藝學報, 2017, 44(3): 452-462.

ZHOU P F, JIA R R, CHEN S C, XU L Z, PENG A H, LEI T G, LI Q, CHEN M, BAI X J, ZOU X P, HE Y R. Cloning and expression analysis of four citrus WRKY genes responding topv.., 2017, 44(3): 452-462. (in Chinese)

[4] 賈瑞瑞,周鵬飛, 白曉晶, 陳善春, 許蘭珍, 彭愛紅, 雷天剛, 姚利曉, 陳敏, 何永睿, 李強. 柑橘響應潰瘍病菌轉錄因子CsBZIP40的克隆及功能分析. 中國農業科學, 2017, 50(13): 2488-2497.

JIA R R, ZHOU P F, BAI X J, CHEN S C, XU L Z, PENG A H, LEI T G, YAO L X, CHEN M, HE Y R, LI Q. Gene cloning and expression analysis of canker-related transcription factor CsBZIP40 in citrus., 2017, 50(13): 2488-2497. (in Chinese)

[5] Zhang J L, Huguet-Tapia J C, Hu Y, Jones J, Wang N, Liu S Z, White F F. Homologues of CsLOB1 in citrus function as disease susceptibility genes in citrus canker., 2017, 18(6): 798-810.

[6] Wang Y, Fu X Z, Liu J H, Hong N. Differential structure and physiological response to canker challenge between ‘Meiwa’ kumquat and ‘Newhall’ navel orange with contrasting resistance., 2011, 128(2): 115-123.

[7] Jia H G, Zhang Y Z, Orbovic V, Xu J, White F F, Jones J B, Wang N. Genome editing of the disease susceptibility gene, 2017, 15(7): 817-823.

[8] Fu X Z, Chen C W, Wang Y, Liu J H, Moriguchi T. Ectopic expression of MdSPDS1 in sweet orange (Osbeck) reduces canker susceptibility: involvement of H2O2production and transcriptional alteration., 2011, 11: 55.

[9] Shimada T, Endo T, Rodriguez A, Fujii H, Goto S, Matsuura T, Hojo Y, Ikeda Y, Mori I C, Fujikawa T, Pena L, Omura M. Ectopic accumulation of linalool confers resistance tosubsp.in transgenic sweet orange plants., 2017, 37(5): 654-664.

[10] Wang Y, Liu J H. Exogenous treatment with salicylic acid attenuates occurrence of citrus canker in susceptible navel orange (Osbeck)., 2012, 169(12): 1143-1149.

[11] Liu J H, Wang W, Wu H, Gong X Q, Moriguchi T. Polyamines function in stress tolerance: from synthesis to regulation., 2015, 6: 827.

[12] Liu J H, Kitashiba H, Wang J, Ban Y, Moriguchi T. Polyamines and their ability to provide environmental stress tolerance to plants., 2007, 24(1): 117-126.

[13] Walters D R. Polyamines and plant disease., 2003, 64(1): 97-107.

[14] Walters D R. Resistance to plant pathogens: possible roles for free polyamines and polyamine catabolism., 2003, 159(1): 109-115.

[15] Marini F, Betti L, Scaramagli S, Biondi S, Torrigiani P. Polyamine metabolism is upregulated in response to tobacco mosaic virus in hypersensitive, but not in susceptible, tobacco., 2001, 149(2): 301-309.

[16] Cowley T, Walters D R. Polyamine metabolism in barley reacting hypersensitively to the powdery mildew fungusf. sp.., 2002, 25: 461-468.

[17] Marina M, Maiale S J, Rossi F R, Romero M F, Rivas E I, Garriz A, Ruiz O A, Pieckenstain F L. Apoplastic polyamine oxidation plays different roles in local responses of tobacco to infection by the necrotrophic fungusand the biotrophic bacterium., 2008, 147(4): 2164-2178.

[18] Yamakawa H, Kamada H, Satoh M, Ohashi Y. Spermine is a salicylate-independent endogenous inducer for both tobacco acidic pathogenesis-related proteins and resistance against tobacco mosaic virus infection., 1998, 118(4): 1213-1222.

[19] Zhang Q H, Wang M, Hu J B, Wang W, Fu X Z, Liu J H.offunctions in dehydration tolerance by reducing stomatal density and maintaining reactive oxygen species homeostasis., 2015, 66(19): 5911-5927.

[20] Wang W, Liu J H.offunctions in polyamine terminal catabolism and inhibits plant growth under salt stress., 2016, 6: 31384.

[21] Bruce T J, Pickett J A. Plant defence signalling induced by biotic attacks., 2007, 10(4): 387-392.

[22] Du M, Zhao J, Tzeng D T W, Liu Y Y, Deng L, Yang T, Zhai Q, Wu F, Huang Z, Zhou M, Wang Q, Chen Q, Zhong S, Li C B, Li C. MYC2 orchestrates a hierarchical transcriptional cascade that regulates jasmonate-mediated plant immunity in tomato., 2017, 29(8): 1883-1906.

[23] Hua J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature., 2013, 16(4): 406-413.

[24] 傅志華, 徐展華, 許渭根. 柑橘潰瘍病田間消長規律及藥劑防治技術. 植保技術與推廣, 2000, 20(6): 34-35.

FU Z H, XU Z H, XU W G. Dynamic regulation in field and the chemical control techniques of citrus canker., 2000, 20(6): 34-35. (in Chinese)

[25] Hadwiger L A, Tanaka K. Non-host resistance: DNA damage is associated with SA signaling for induction of PR genes and contributes to the growth suppression of a pea pathogen on pea endocarp tissue., 2017, 8: Article 446.

[26] Singh K B, Foley R C, O?ate-Sánchez L. Transcription factors in plant defense and stress responses., 2002, 5(5): 430-436.

[27] Liu J H, Ban Y, Wen X P, Nakajima I, Moriguchi T. Molecular cloning and expression analysis of an arginine decarboxylase gene from peach ()., 2009, 429(1/2): 10-17.

[28] Kasukabe Y, He L X, Nada K, Misawa S, Ihara I, Tachibana S. Overexpression of spermidine synthase enhances tolerance to multiple environmental stresses and up-regulates the expression of various stress regulated genes in transgenic., 2004, 45(6): 712-722.

[29] Mitsuya Y, Takahashi Y, Berberich T, Miyazaki A, Matsumura H, Takahashi H, Terauchi R, Kusano T. Spermine signaling plays a significant role in the defense response ofto cucumber mosaic virus., 2009, 166(6): 626-643.

[30] Moschou P N, Paschalidis K A, Roubelakis-Angelakis K A. Plant polyamine catabolism., 2008, 3(12): 1061-1066.

[31] Moschou P N, Sanmartin M, Andriopoulou A H, Rojo E, Sanchez-Serrano J J, Roubelakis-Angelakis K A. Bridging the gap between plant and mammalian polyamine catabolism: a novel peroxisomal polyamine oxidase responsible for a full back-conversion pathway in., 2008, 147(4): 1845-1857.

[32] Yoda H, Hiroi Y, Sano H. Polyamine oxidase is one of the key elements for oxidative burst to induce programmed cell death in tobacco cultured cells., 2006, 142(1): 193-206.

[33] Cowley T, Walters D R. Polyamine metabolism in an incompatible interaction between barley and the powdery mildew fungus,f. sp.., 2002, 150(11/12): 581-586.

[34] Rea G, Metoui O, Infantino A, Federico R, Angelini R. Copper amine oxidase expression in defense responses to wounding andinvasion., 2002, 128(3): 865-875.

[35] Yoda H, Yamaguchi Y, Sano H. Induction of hypersensitive cell death by hydrogen peroxide produced through polyamine degradation in tobacco plants., 2003, 132(4): 1973-1981.

[36] Yoda H, Fujimura K, Takahashi H, Munemura I, Uchimiya H, Sano H. Polyamines as a common source of hydrogen peroxide in host- and nonhost hypersensitive response during pathogen infection., 2009, 70(1/2): 103-112.

[37] Gururani M A, Venkatesh J, Upadhyaya C P, Nookaraju A, Pandey S K, Park S W. Plant disease resistance genes: Current status and future directions., 2002, 78: 51-65.

[38] Jwa N S, Agrawal G K, Tamogami S, Yonekura M, Han O, Iwahashi H, Rakwal R. Role of defense/stress-related marker genes, proteins and secondary metabolites in defining rice self-defense mechanisms., 2006, 44(5/6): 261-273.

[39] Mullineaux P M, Rausch T. Glutathione, photosynthesis and the redox regulation of stress-responsive gene expression., 2005, 86(3): 459-474.

[40] Agrawal G K, Rakwal R, Jwa N S, Han K S, Agrawal V P. Molecular cloning and mRNA expression analysis of the first rice jasmonate biosynthetic pathway gene allene oxide synthase., 2002, 40(9): 771-782.

（責任編輯 岳梅）

Influence of Temperature and Polyamines on Occurrence of Citrus Canker Disease and Underlying Mechanisms

YANG Feng1, CHEN ChuanWu2, FAN QiJun2, SHI ChunMei1, XIE ZongZhou1, GUO DaYong1, LIU JiHong1

(1College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Wuhan 430070;2Guangxi Academy of Specialty Crops/Guangxi Key Laboratory of Citrus Biology, Guilin 541004, Guangxi)

【Objective】 Canker disease is one of the most devastating diseases that cause serious damages to citrus. It is more likely to occur under high temperature. The objective of this study is to elucidate the mechanism underlying the disease incidence at high temperatures, reveal its metabolic changes, and to provide important theoretical guidance for controlling the disease using certain chemicals.【Method】 Sweet orange (), which is sensitive to canker disease, was used as the experimental material. The sweet orange plants were pre-cultured for 3 d at either 21℃ or 30℃ prior to inoculation withsubsp.(), followed by evaluation of disease incidence. Expression of four defense-related genes, including(allene oxide synthase),(chitinase),(glutathione peroxidase) and(pathogenesis-related protein 4A), in the plants pre-cultured at the two temperatures was assessed by semi-quantitative RT-PCR. Meanwhile, endogenous polyamines (putrescine, spermidine and spermine) in the plants pre-cultured at the two temperatures were also analyzed by HPLC. In addition, sweet orange plants were treated with exogenous spermidine (0.4 mmol·L-1), using water treatment as a control, beforeinoculation. Disease incidence and index of plants treated with either spermidine or water were compared, while endogenous polyamine contents and expression levels of defense-related genes (,,and) in response to spermidine or water treatment were assessed. 【Result】 After inoculation with, it was found that plants pre-cultured at 21℃ exhibited a lower cankder disease incidence at the early stage when compared with the plants pre-cultured at 30℃. On the 10th day, the incidence of the two treatments was similar. HPLC analysis showed that content of the three free polyamines (putrescine, spermidine and spermine) in plants pre-cultured at 21℃was significantly higher than that in the plants pre-cultured at 30℃. In addition, RT-PCR analysis indicated that the transcript level of three defense-related genes,,and, in plants kept at 21℃ was higher than that from 30℃, while there was no significant difference inexpression between the two groups. Exogenous application of spermidine remarkably enhanced levels of endogenous putresicne and spermidine, reduced disease incidence and index in comparison with water treatment. Spermidine treatment reduced the disease incidence by 45% and in comparison with the control after 14 days of inoculation. In addition, the disease index of the spermidine-treated samples was 4.8 lower than that of the control.Meanwhile, the phenotype indicated that the control displayed more serious symptom than that of spermidine treatment. Moreover, spermidine treatment could up-regualte mRNA abundances of all four defense-realted genes, including,,and.【Conclusion】Sweet orange displayed susceptibility to citrus canker at high temperature, and the potential mechanisms underlying this phenomenon may be ascribed to inhibition of defense-related genes and suppression of polyamine biosynthesis. Exogenous polyamine treatment conferred enhanced tolerance to citrus canker by upregulating defense-related genes and triggering disease resistance response. Taken together, high temperature is one of the environmental factors accounting for outbreak of citrus canker disease, and polyamines are conducive for improving tolerance to citrus canker disease.

citrus; canker disease; high temperature; polyamines; defense-related genes; disease resistance

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.009

2017-10-16；

2017-12-06

國家公益性行業（農業）科研專項（201003067）、萬人計劃創新領軍人才、湖北省自然科學基金創新群體（2017CFA018）、廣西柑橘生物學重點實驗室培育基地開放課題（桂柑科201202k003，桂柑科201201z004）

楊楓，E-mail：124272531@qq.com。陳傳武，E-mail：jk_ccw@126.com。楊楓和陳傳武為同等貢獻作者。通信作者劉繼紅，Tel：027-87282399；E-mail：liujihong@mail.hzau.edu.cn