生物炭及炭基肥對土壤微生物群落結構的影響

陳坤，徐曉楠，彭靖，馮小杰，李亞朋，戰(zhàn)秀梅，韓曉日

?

生物炭及炭基肥對土壤微生物群落結構的影響

陳坤，徐曉楠，彭靖，馮小杰，李亞朋，戰(zhàn)秀梅，韓曉日

（沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院/土肥資源高效利用國家工程實驗室，沈陽 110866）

【目的】微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起到轉換者的作用。論文以傳統有機肥（玉米秸稈和豬廄肥）為對照，探究施用生物炭和炭基肥等新型有機物料培肥改土對土壤微生物群落結構的影響，以期為不同有機物料合理施用提供理論參考。 【方法】 依托沈陽農業(yè)大學棕壤改土定位試驗平臺（始于2009年），利用磷脂脂肪酸（PLFA）技術研究長期不同有機無機配施條件下土壤理化性質和微生物群落結構特征及二者的相關關系。試驗處理包括：秸稈配施化肥還田（CS）、豬廄肥配施化肥（PMC）、炭基肥（BF）以及生物炭配施化肥（BIO）。【結果】PMC和BF處理的pH顯著高于BIO處理；PMC處理的全氮含量顯著高于BF和CS處理，BIO與PMC處理沒有顯著差異；PMC處理的有機質含量顯著高于BF和BIO處理；PMC處理的土壤含水量最高；不同處理間土壤全鉀含量沒有顯著差異。PMC處理的土壤微生物總PLFAs含量最高，其他處理間沒有差異；PMC處理的細菌PLFAs含量最高，BF處理的細菌PLFAs含量顯著低于BIO和CS處理；PMC處理的真菌、革蘭氏陽性和陰性細菌PLFAs含量顯著高于BIO處理，BF與PMC處理差異不顯著；PMC處理的放線菌含量顯著高于CS處理，BF和BIO處理居于中間無顯著差異。BF處理的Shannon-Winner多樣性指數和真菌/細菌比值顯著高于BIO處理，BF和PMC處理的革蘭氏陽性/陰性細菌比值顯著低于BIO處理。冗余分析（RDA）結果顯示，土壤pH、全氮和有機質對土壤微生物各PLFA有極顯著影響（<0.01），含水量和全鉀有顯著影響（<0.05）。【結論】生物炭和炭基肥長期施用明顯改善了土壤理化性質；相較豬廄肥，施用生物炭不利于真菌和革蘭氏陰性細菌的積累，而且施用生物炭和炭基肥對土壤微生物群落的影響不同，施用生物炭有利于細菌群落的繁殖，施用炭基肥有利于土壤真菌/細菌比和土壤微生物群落結構多樣性的提高；土壤pH、全氮、有機質、含水量和全鉀依次是影響土壤微生物群落的重要因子。

生物炭；炭基肥；磷脂脂肪酸；群落結構；土壤微生物

0 引言

【研究意義】土壤微生物是土壤中物質循環(huán)和能量流動不可或缺的參與者[1]，也是土壤養(yǎng)分的“源”和“匯”，支撐著土壤肥力，對環(huán)境變化極為敏感，土壤中的微小變動都會引起其活性的變化[2]。生物炭（Biochar）是由農林廢棄物等在缺氧環(huán)境下加熱裂解制成的一種穩(wěn)定有機物，可作為富碳土壤改良劑[3]。生物炭基肥料（炭基肥）是由生物炭與普通化學肥料復合而成的緩釋肥料[3-5]。磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）標記方法快速、準確、靈敏，技術成熟，可以有效測定土壤不同微生物群落生物量[6-7]。通過研究生物炭和炭基肥定位施用后土壤微生物群落結構的變化來判斷不同有機物料改良土壤效果，可以為農田土壤培肥提供生態(tài)學方面的理論依據。【前人研究進展】生物炭在制備過程中形成了多孔隙、大比表面積的結構，且具有高含碳量、多芳香烴、多極性官能團的組成[3]，理化性質穩(wěn)定[3,8]，使其成為優(yōu)良的土壤改良劑[9]。相關研究[4, 10-11]表明，生物炭施入土壤后提高了土壤含水量、pH、孔隙度、CEC以及養(yǎng)分水平，基于其本身的結構和性質，也能為微生物提供適宜生存的微環(huán)境，對不同微生物群落產生影響[12]。細菌能夠吸附到生物炭的表面而不易被淋洗[13]，且生物炭的吸附作用取決于其孔隙的大小[14]。生物炭的微孔結構能為真菌提供“避難”場所，可以避免物種內的競爭[15]。生物炭疏松多孔的結構特征，可如海綿一樣保持與空氣和水分的共通性，RONDON發(fā)現經生物炭處理的退化土壤固氮細菌能有效吸收來自大氣的氮素[16]，原因是通過提高土壤通氣性，增大氧分壓來刺激氮細菌的活性[17]。生物炭本身富含多種養(yǎng)分，特別是易被微生物利用的碳源和氮源，有利于微生物尤其是細菌的活動[18]。O'NEILL利用同位素示蹤法標記氨基酸和核苷酸，檢測到添加生物炭后細菌活性和土壤呼吸速率增強，說明施用生物炭能夠提高細菌對土壤碳的利用率[19]。研究還發(fā)現，生物炭的施用量[3]，也會對土壤微生物的群落多樣性產生影響。【本研究切入點】沈陽農業(yè)大學植物營養(yǎng)與施肥研究室于2009年春天布置生物炭及炭基肥棕壤改土定位試驗，觀測長期施用條件下的培肥效果，同時以傳統的培肥改土措施——玉米秸稈還田和豬廄肥為對照，對比研究不同有機物料連續(xù)多年施用培肥改土的特征及優(yōu)勢。本試驗的前期研究結果表明，生物炭和炭基肥等各有機物料處理均改善了土壤理化性質[4]，增加了土壤總有機碳和活性有機碳各組分碳含量，對土壤酶活性產生了一定影響[21]。土壤有機碳和土壤酶的變化與土壤微生物的群落活性息息相關[1]，同時土壤微生物活性的變化與土壤養(yǎng)分的變異有關[20]，因此生物炭和炭基肥長期施用是否改變了土壤微生物群落值得探索。【擬解決的關鍵問題】本研究探討生物炭和炭基肥連續(xù)施用7年后的土壤理化性質變化和土壤微生物群落結構特征及二者的相關關系，以期揭示生物炭培肥改土的生物學機理。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點和材料

田間微區(qū)試驗于2009年5月開始，布置在沈陽農業(yè)大學國家花生產業(yè)技術體系土壤肥料長期定位試驗基地（41°83′N，123°56′E）。試驗區(qū)屬溫帶濕潤-半濕潤季風氣候，年均溫度7.0—8.1℃，無霜期為147—164 d，年均降雨量574—684 mm。供試土壤屬第四紀黃土母質發(fā)育的簡育濕潤淋溶土典型棕壤。2008年布置試驗前土壤基本理化性質如下：土壤有機質1.53 g·kg-1，土壤全氮0.86 g·kg-1，土壤全磷0.42 g·kg-1，土壤全鉀20.40 g·kg-1，堿解氮51.30 mg·kg-1，有效磷4.60 mg·kg-1，速效鉀114.50 mg·kg-1，pH 5.5（水土比5﹕1）。土壤以2﹕1型黏粒礦物為主，主要是水云母（Hydrous mica），1﹕1型高嶺石（Kaolinte）含量次之，蒙脫石（Montmorillonite）含量最低，CEC為8.32 cmol·kg-1。土壤質地：砂粒含量510 g·kg-1，粉粒含量280 g·kg-1，黏粒（＜2 μm）含量210 g·kg-1，土質較黏。供試作物為花生，品種為阜花12。

1.2 試驗設計

試驗處理之間為相互對照，分為傳統有機物料（玉米秸稈和豬廄肥）培肥改土處理和新型有機物料（生物炭顆粒和炭基肥）培肥改土處理。處理1：玉米秸稈（CS）4 500 kg·hm-2+ NPK；處理2：豬廄肥（PMC）4 000 kg·hm-2+ NPK；處理3：炭基肥（BF）750 kg·hm-2（養(yǎng)分含量11-11-13）和處理4：生物炭顆粒（BIO）1 500 kg·hm-2+ NPK。設計處理1—4等養(yǎng)分（全量NPK），由于秸稈（CS）、豬廄肥（PMC）和生物炭顆粒（BIO）等有機物料本身養(yǎng)分含量低，以化肥（肥種類為尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀）配施，使所有處理全量NPK養(yǎng)分相等，與炭基肥（BF）處理施用養(yǎng)分含量一致。表1為2015年各有機物料養(yǎng)分含量；生物炭顆粒為玉米芯450℃裂解，過篩添加膠結劑造粒，出炭率3﹕1；秸稈粉碎至2—3 cm，豬廄肥當年腐熟。每年5月初春播前將全部肥料當基肥施用，與土壤耕層混合后備壟，9月底收獲后移除全部植株。試驗設3次重復，隨機區(qū)組排列，微區(qū)面積2 m2，微區(qū)間20 cm水泥埂分隔，微區(qū)內花生采用大壟雙行種植，每池種植30穴。

表1 各有機物料干基養(yǎng)分（%）和pH

有機物料的養(yǎng)分含量為2015年的測定值 The nutrient of resources was measured in 2015

CS: Corn straw-returning; PMC: Piggery manure compost; BF: Biochar-based compound fertilizer; BIO: Biochar. 下同The same as below

1.3 試驗方法

1.3.1 采集處理土樣 2015年花生收獲期（9月28日）采集微區(qū)0—20 cm土層土樣，混合均勻后分兩份，一份風干后用于土壤基本理化性質測定。另一份放入-80℃冰箱冷藏保存，用于冷凍干燥提取活體微生細胞膜脂肪酸。

1.3.2 基本理化性質測定 土壤含水量（MC）測定采用恒溫箱烘干法；土壤全氮（TN）測定采用Dumas干燒法（德國VarioEL–Ⅲ型元素分析儀）；土壤有機碳（SOC）測定采用重鉻酸鉀容量法；土壤全鉀（TK）測定采用氫氧化鈉熔融-火焰光度計比色法（Sherwood M410火焰光度計）；pH采用電極法按土水比1﹕5測定（雷磁PHS-3G）。

1.3.3 PLFA提取與測定

（1）PLFA的提取采用BOSSIO等[22]的方法，測定采用MIDI公司MIS系統鑒定。具體分為以下幾步。

①浸提 稱取4.000 g凍干土樣于聚四氟乙烯離心管中，加入15.2 mL混合浸提液（加液順序依次為：3.2 mL檸檬酸緩沖液，4.0 mL氯仿，8.0 mL甲醇）。25℃避光振蕩2.5 h，4 000 r/min離心10 min后上清液轉移到提前加入8.0 mL氯仿和8.0 mL檸檬酸緩沖液的玻璃試管中，重復上述步驟一次并轉移上清液，最終使氯仿﹕甲醇﹕檸檬酸緩沖液體積比=1﹕1﹕0.9。振蕩試管1 min并定時放氣。提取液避光靜置過夜待分層。

②分離 用玻璃吸管吸取分層后的上層水溶性液體（一樣一只吸管，不要吸到下層氯仿）。試管于通風櫥內避光條件通入純N2吹干氯仿層（保證整個過程試管充滿N2）。濃縮后的脂肪酸用5 mL氯仿分5次轉移到氯仿活化的硅膠固相萃取柱內，依次用8 mL氯仿、16 mL丙酮和8 mL甲醇洗脫萃取柱，收集甲醇洗脫液于玻璃離心管內，通風櫥避光條件下純N2吹干甲醇相。

③甲酯化玻璃離心管內加入1.0 mL甲醇-甲苯混合溶液（體積比1﹕1）和1.0 mL的0.2 mol·L-1KOH-甲醇溶液，混勻后35℃水浴15 min。冷卻至室溫后依次加入2.0 mL去離子水、0.3 mL的1 mol·L-1HAc和2.0 mL正己烷，渦旋30 s后2 500 r/min離心10 min，使用玻璃吸管吸取上層正己烷相于樣品瓶內（一樣一只吸管），重復上述步驟一次合并正己烷，通風櫥內避光條件下純N2吹干正己烷，即得到甲酯化磷脂脂肪酸（FAME）。

④PLFA圖譜分析樣品瓶內加入150 μL正己烷溶解樣品，加入50 μL的40 μg·mL-119:0甲基酯作內標用于定量，過氣相色譜柱（Agilent GC 7890A），利用美國MIDI公司開發(fā)的Sherlock Microbial Identification System（MIS）4.5系統進行脂肪酸的比對鑒定。

（2）各微生物群落表征 研究認為不同微生物群落的PLFA圖譜存在較大差異，而同一類群的微生物PLFA圖譜則很相近，因而可以利用某些特征PLFA表征某一類群的微生物[23]。通常：n14:0-n20:0為普通直鏈飽和脂肪酸，表征細菌/總微生物量[23]；18:1 ω9c、18:2 ω6c、18:3 ω6c、16:1 ω5c表征真菌（Fungi）群落微生物量[24-26]；16:0 10-methyl、17:0 10-methyl、18:0 10-methyl、17:1 w7c 10-methyl表征放線菌（Actinobacteria）群落微生物量[24, 27]；14:0 iso、15:0 iso/ anteiso、16:0 iso、17:0 iso/ anteiso、17:1 iso ω9c表征革蘭氏陽性細菌（G+）群落微生物量[6]；16:1ω7c、16:1ω9c、17:1ω8c、18:1ω7c、17:0 cycle ω7c、19:0 cycle ω7c表征革蘭氏陰性細菌（G-）群落微生物量[6]；飽和直鏈脂肪酸、革蘭氏陽性細菌（G+）、革蘭氏陰性細菌（G-）和放線菌微生物量之和表示細菌群落微生物量，同時將所有微生物PLFAs總和表征為總微生物量。

（注：不同PLFA分子常以一系列C原子數目結合字母表示[28]，如18:1 ω6c，18代表脂肪酸含18個C原子，1代表含有一個雙鍵，ω及后面的數字代表雙鍵與脂肪端的距離；脂肪酸的順勢和反式構型分別用字母c和t表示，字母標在后面；有甲基異型存在時用anteiso和iso表示，分別指甲基在脂肪端末尾第3個和第2個C原子上；methyl表示甲基，前面的數字代表甲基距離羧基端距離；cycle表示為環(huán)丙烷脂肪酸。）

1.4 數據處理

利用SPSS19.0和 Excel2010軟件對數據進行方差分析、顯著檢驗和相關分析并作圖。利用Canoco4.5軟件對微生物群落PLFA進行冗余分析（redundancy analysis，RDA）并作圖。

利用Shannon-Winner多樣性指數（）、Pielou平均度指數（）和Simpson豐富度指數（）以PLFA為指征計算微生物多樣性。計算公式如下：

=-ΣPlnP

=/ln

= 1-∑P2

式中，P是第種磷脂脂肪酸的相對豐度，即種特征磷脂脂肪酸的含量除以樣品中特征磷脂脂肪酸的總含量；為每個樣品中鑒定到的可供分析用的特征PLFA的種類數量。

2 結果

2.1 施用生物炭和炭基肥對土壤理化性質影響

由表2可知不同處理間全鉀含量差異不顯著（＞0.05）；PMC和BF處理的pH最高，顯著高于BIO處理；CS和BF處理的土壤全氮含量最低，顯著低于PMC處理，BIO處理居間；BF和BIO處理有機質含量最低，顯著低于PMC處理；PMC處理的土壤含水量最高，其他處理間沒有顯著差異。

2.2 施用生物炭和炭基肥對土壤微生物群落結構影響

PMC處理的土壤微生物總PLFAs含量顯著高于其他處理（圖1），其余處理間則沒有顯著差異。細菌PLFAs含量仍以PMC處理最高，BF最低，CS和BIO處理居中且二者間無顯著差異。放線菌PLFAs含量以CS處理最低，與PMC處理存在顯著差異，BF和BIO處理居間無顯著性差異。BIO處理的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的PLFAs（圖2）含量均最低，與PMC處理存在顯著差異。

表2 不同處理對土壤理化性質的影響

每列數據后不同小寫字母表示Duncan多重比較不同處理差異顯著，數據表示平均值±標準誤差。下同

Different small letters within one column mean significant difference of Duncan multiple range test among different treatments at 5% level. Data were expressed as means±SE. The same as below

圖1 不同處理土壤微生物的特征 PLFAs 含量

圖2 不同處理革蘭氏陽性與陰性細菌菌落的特征 PLFAs 含量

不同處理間的Pielou均勻度指數和Simpson優(yōu)勢度指數均沒有顯著差異（表3），Shannon-Winner多樣性指數BF處理顯著高于BIO處理， PMC和CS處理居間沒有顯著差異。真菌PLFAs/細菌PLFAs比值（圖3-a）BIO處理最低，其余3種處理之間沒有顯著差異，革蘭氏陽性細菌PLFAs/革蘭氏陰性細菌PLFAs比值（圖3-b）BF和PMC處理最低，顯著低于BIO處理。

2.3 土壤微生物PLFA與土壤理化指標的關系

以不同PLFA為物種因子對不同理化指標做約束性排序（RDA分析），利用蒙特卡羅P值檢驗中有顯著貢獻（＜0.05）的環(huán)境因子與物種因子做物種-環(huán)境雙序圖（圖4），結果顯示，第1主軸和第2主軸分別解釋了微生物群落結構與理化性質關系總變異的76.3%和6.4%；對PLFA豐度有顯著影響的土壤理化指標及重要性排序分別是土壤pH、全氮、有機質、含水量和全鉀（表4），其中含水量和全鉀對土壤微生物群落有顯著影響（< 0.05），pH、全氮和有機質對土壤微生物群落有極顯著影響（< 0.01）。pH和全氮與16:1 ω7c、18:1 ω7c（G-）、15:0 iso、15:0 anteiso（G+）、16:1 ω5c、18:1 ω9c（真菌）和16:0 10-methyl、18:0 10-methyl（放線菌）存在明顯正相關，有機質與16:1 ω5c 、18:2 ω6c（真菌）、17:0 cycle ω7c（G-）、17:0 anteiso（G+）相關性較高，含水量和17:1 w7c 10-methyl（放線菌）、16:1 ω9c（真菌）、17:0 iso（G+）和17:1 ω8c 、19:0 cycle ω7c（G-）相關性強，全鉀和17:0 10-methyl（放線菌）、16:0 iso、14:0 iso、17:1 iso ω9c（G+）和14:0、20:0（細菌）相關性較高。

表3 不同處理土壤微生物多樣性指數

圖3 不同處理土壤中真菌/細菌(a)、革蘭氏陽性細菌/革蘭氏陰性細菌(b)比

圖4 土壤微生物群落結構和土壤化學性質的RDA分析

相關分析結果表明（表5），土壤pH與真菌、革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌PLFAs含量極顯著相關，與放線菌PLFAs顯著相關；全氮與革蘭氏陽性與陰性細菌PLFAs含量極顯著相關，與真菌與放線菌PLFAs含量顯著相關；有機質與真菌PLFAs含量極顯著相關，與革蘭氏陽性與陰性細菌PLFAs含量顯著相關；含水量與真菌、放線菌、革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌PLFAs含量顯著相關；全鉀和總PLFAs與細菌PLFAs含量極顯著相關，和放線菌與革蘭氏陽性細菌PLFAs含量顯著相關。

表4 理化因子變量解釋的重要性排序與顯著性檢驗

表5 土壤微生物不同群落與土壤化學性質的相關性

*在0.05 水平上顯著相關。**在0.01水平上顯著相關 * Mean significant difference at 0.05 level. ** Mean significant difference at 0.01 level

3 討論

各有機物料連續(xù)施用7年后，土壤理化性質發(fā)生了較大變化。與試驗前相比（土壤pH5.5，全氮0.86 g·kg-1，有機質15.3 g·kg-1，全鉀20.40 g·kg-1）不同處理pH、全氮、有機質和全鉀含量均有所提高。生物炭制備過程中礦質元素趨于離子態(tài)存在，損失不大，施入土壤后顯堿性可以提升土壤酸堿度[29]，其中炭基肥和豬廄肥處理提升幅度最大，這可能是炭基肥和腐熟的豬廄肥施入土壤后不會產生過多中間酸性產物[4]，而生物炭處理施用的生物炭顆粒添加了酸性膠結劑（各有機物料pH見表1），秸稈也會在土中腐解產生酸性物質[4]。生物炭對土壤全氮含量的提高是由于在燒制過程中氮的狀態(tài)發(fā)生了轉變[30]，出現較多以C-N雜環(huán)穩(wěn)定形態(tài)存在的氮[31]，施入土壤能夠長時間保持穩(wěn)定不易被分解[32]，與此相似，在碳素每年投入不等量的情況下（CS、BIO和BF分別為1 999.8、499.8和57.98 kg·hm-2，有機物料含碳量見表1），生物炭和炭基肥處理有效提高土壤有機質含量且在長期施用中與CS處理達到相同水平。

植物種類、土壤性質以及土壤的管理方式是影響土壤微生物的主要因素[33]。本試驗中PMC處理的各種微生物群落生物量均較為豐富，主要的原因有：腐熟的豬廄肥含有大量活性微生物，對于土壤起到“接種”的作用[34]；豬廄肥本身養(yǎng)分（主要是碳、氮）相較秸稈和生物炭更適宜微生物的繁殖[7]。生物炭對微生物的影響主要有兩方面，一是生物炭本身多孔性的微觀結構和巨大比表面積可為微生物提供適宜生境[15]，二是生物炭除了本身能提供少量營養(yǎng)物質外還可以通過吸附養(yǎng)分或改良土壤性質間接影響微生物群落[13]。細菌一般是土壤微生物中的優(yōu)勢群落[6]，本試驗中不同處理細菌PLFAs占總PLFAs含量的比值均在75%以上，生物炭對微生物的影響首先體現在細菌群落中，炭基肥處理由于所含生物炭量不高（57.98 kg·hm-2），對土壤細菌微生物群落的影響不及生物炭處理（499.8 kg·hm-2）顯著。細菌和真菌對土壤有機物質的分解途徑不同，真菌易生存于低營養(yǎng)、難分解以及低氮含量有機物的環(huán)境，底物循環(huán)時間偏長；細菌則相反，偏好生存在營養(yǎng)豐富、有機物易于分解的土壤中，底物周轉快[35]。本研究中生物炭處理的真菌PLFAs含量最低，相較豬廄肥處理不利于真菌積累。可能的原因是真菌生長并不過多依賴生物炭孔隙和生物炭帶來的無機營養(yǎng)，而試驗所用的玉米芯生物炭也沒能提供足夠數量的適宜真菌生存的孔隙[15]。JIN等[36]施用生物炭的改土試驗還曾發(fā)現過真菌遺傳多樣性和數量減少的現象。

微生物群落結構關乎生態(tài)系統的穩(wěn)定和健康[6, 37]，FTDE等[38]的研究發(fā)現，真菌/細菌生物量比值與農田生態(tài)系統穩(wěn)定性相關，一些研究[42]也表明真菌/細菌生物量比值與微生物多樣性存在相關性。本研究中炭基肥處理的Shannon-Winner多樣性指數和真菌/細菌比值均最高，顯著高于生物炭處理，說明相較生物炭處理施用炭基肥更有利于提高土壤微生物的群落結構多樣性，生物炭處理相較炭基肥處理更有利于細菌群落PLFAs生物量的生長是引起這一差異的原因。支鏈飽和脂肪酸與環(huán)化單烯等不飽和脂肪酸通常分別是革蘭氏陽性和陰性細菌的特征標記物[25]，其比值也常用來表示土壤微生物群落結構[39]及與環(huán)境的關系[38, 40]，比值高低與環(huán)境脅迫程度有關[20]。本研究中生物炭處理的G+/G-比值最高，說明施用生物炭對土壤微生物的脅迫程度較施用豬廄肥和炭基肥要高一些。但生物炭處理的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌PLFAs含量均低于豬廄肥處理，說明相比豬廄肥，生物炭處理更不利于革蘭氏陰性細菌的積累，這與STEINBEISS等[12]的研究施入生物炭能增加土壤革蘭氏陰性細菌生物量的結論似有不符，但本試驗中炭基肥處理卻沒有這種現象，可能的原因是炭基肥和生物炭處理施入土壤的純生物質炭量不同（BIO和BF分別為499.8 kg·hm-2和57.98 kg·hm-2），導致不同處理土壤微生物受脅迫程度不同。

土壤理化性質如pH、含水量、有機質和土壤養(yǎng)分也是影響土壤微生物群落的重要因素[20, 41]。本研究RDA分析結果顯示，pH、全氮和有機質對土壤微生物影響最大，呈極顯著相關，這與許多研究結果[6-7, 42]類似，pH對微生物適宜生存環(huán)境影響巨大[2]，氮素是微生物必不可少的養(yǎng)分元素[1]，而有機質是土壤養(yǎng)分最重要的衡量指標，說明這三種因素是影響本試驗微生物群落的關鍵因子，其他顯著影響因子還包括土壤含水量與全鉀。但在重要性排序上pH位于全氮和有機質之前，此結果似乎和一些文獻[7]相沖突，這主要有以下幾方面原因：首先全氮和有機質并不是對所有微生物群落有顯著影響，由表5可知全氮和有機質只是與部分微生物群落極顯著相關，全氮與革蘭氏陽性與陰性細菌，有機質與真菌，而土壤pH與真菌、革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌均極顯著相關；其次生物炭等有機物料擁有巨大的比表面積，pH的變化會對生物炭表面可變負電荷產生影響，造成銨態(tài)氮和磷素等營養(yǎng)元素的吸附障礙從而影響其對土壤微生物的有效性[2]。

生物炭被認為是改善土壤肥力和土壤生態(tài)，可通過固碳減緩氣候變化的有效手段[10,18]，其對土壤的影響機理[4,8,10,21]多被解釋為通過提高土壤pH和吸附作用改善土壤養(yǎng)分利用情況，同時改變土壤微生物群落組成及豐度[12,18-19]，進而對土壤養(yǎng)分循環(huán)或理化性質產生作用[11-12]，最終影響作物生長[11]。這些研究多數集中在土壤性質或微生物分化差異上，關于施用生物炭的土壤在功能微生物作用下養(yǎng)分變異過程的內涵并沒有系統深入闡述。現有的研究[3-4,8-12,18]為未來關于生物炭對土壤微生物群落功能性的研究提供了廣闊思路，如不同生物炭與土壤不同養(yǎng)分及相關酶與功能微生物的互作，生物炭與更廣泛的微生物（土壤動物等）功能性研究，除本文研究的炭基肥外的生物炭菌劑等生物炭功能性產品，生物炭微生物環(huán)境風險等方面[18]都值得我們去探索。

4 結論

長期施用生物炭和炭基肥可以改善土壤的理化性質。相較豬廄肥，施用生物炭不利于真菌和革蘭氏陰性細菌群落生物量的積累，且施用生物炭和炭基肥對土壤微生物群落的影響不同，施用生物炭可以顯著提高土壤細菌生物量，施用炭基肥能顯著提高土壤微生物Shannon-Winner多樣性指數和真菌/細菌比以及降低革蘭氏陽性細菌/革蘭氏陰性細菌比，有利于土壤微生物群落結構多樣性提高。

長期應用生物炭等有機物料培肥改土后，土壤理化指標對微生物群落產生顯著影響的因子及重要性依次為pH、全氮、有機質、含水量和全鉀，其中前3種因素的影響極顯著。

[1] 徐陽春, 沈其榮, 冉煒. 長期免耕與施用有機肥對土壤微生物生物量碳、氮、磷的影響. 土壤學報, 2002, 39(01): 83-90.

XU Y, C, SHEN Q R, RAN W. Effects of zero-tillage and application of manure on soil microbial biomass C,N and P after sixteen years of cropping., 2002, 39(01): 83-90. (in Chinese)

[2] 李春越, 王益, BROOKES P, 黨廷輝, 王萬忠. pH對土壤微生物C/P比的影響. 中國農業(yè)科學, 2013, 46(13): 2709-2716.

LI C Y, WANG Y, BROOKES P, DANG T H, WANG W Z.Effect of soil pH on soil microbial carbon phosphorus ratio., 2013, 46(13): 2709-2716. (in Chinese)

[3] 陳溫福, 張偉明, 孟軍. 農用生物炭研究進展與前景. 中國農業(yè)科學, 2013, 46(16): 3324-3333.

CHEN W F, ZHANG W M, MENG J. Advances and prospects in research of biochar utilization in agriculture., 2013, 46(16): 3324-3333. (in Chinese)

[4] 戰(zhàn)秀梅, 彭靖, 王月, 劉軼飛, 陳坤, 韓曉日, 王恒飛, 藺文成, 李喜研. 生物炭及炭基肥改良棕壤理化性狀及提高花生產量的作用. 植物營養(yǎng)與肥料學報, 2015, 21(6): 1633-1641.

ZHAN X M, PENG J, WANG Y, LIU Y F, CHEN K, HAN X R, WANG H F, LIN W C, LIX Y. Influences of application of biochar and biochar-based fertilizr on brown soil physiochemical properties and peanut yields., 2015, 21(6): 1633-1641. (in Chinese)

[5] 陳溫福, 韓曉日, 徐正進, 劉金. 一種炭基緩釋花生專用肥料及其制備方法:CN101121619. 2008-02-13.

CHEN W F, HAN X R, XU Z J, LIU J. Biochar-based slow release peanut fertilizer and preparation method: CN101121619. 2008-02-13. (in Chinese)

[6] 王巍巍, 趙瓊, 趙欣然, 曾德慧, 艾桂艷. 凋落物管理對樟子松人工林土壤微生物群落結構的影響. 生態(tài)學雜志, 2015, 34(9): 2605-2612.

WANG W W, ZHAO Q, ZHAO X R, ZENG D H, AI G Y. Effects of litter manipulation on soil microbial community structure in a Pinus sylvestris var.mongolica plantation., 2015, 34(9): 2605-2612. (in Chinese)

[7] 郭蕓, 孫本華, 王穎, 魏靜, 高明霞, 張樹蘭, 楊學云. 長期施用不同肥料土plfa指紋特征. 中國農業(yè)科學, 2017, 50(1): 94-103.

GUO Y, SUN B H, WANG Y, WEI J, GAO M X, ZHANG S L, YANG X Y. PLFA fingerprint characteristics of an anthropogenic loess soil under long-term different fertilizations., 2017, 50(1): 94-103. (in Chinese)

[8] 何緒生, 耿增超, 佘雕, 張保健, 高海英. 生物炭生產與農用的意義及國內外動態(tài). 農業(yè)工程學報, 2011, 27(2): 1-7.

HE X S, GENG Z C, SHE D, ZHANG B J, GAO H Y. Implications of production and agricultural utilization of biochar andits international dynamic., 2011, 27(2): 1-7. (in Chinese)

[9] WOOLF D, AMONETTE J E, STREETPERROT F A, LEHMANN J, JOSEPH S.Sustainable biochar to mitigate global climate change., 2010, 1(5): 56. DOI:10.1038/ncomms1053.

[10] LEHMANN J, GAUNT J, RONDON M, READ P. Bio-char sequestration in terrestrial ecosystems - a review., 2006, 11(2): 395-419.

[11] ASAI H, SAMSON B K, STEPHAN H M, SONGYIKHANGSUTHOR K, HOMMA K, KIYONO Y, INOUE Y, SHIRAIWA T, HOEIR T. Biochar amendment techniques for upland rice production in Northern Laos: 1. Soil physical properties, leaf SPAD and grain yield., 2009, 111 (1/2): 81-84.

[12] STEINBEISS S, GLEIXNER G, ANTONIETTI M. Effect of biochar amendment on soil carbon balance and soil microbial activity., 2009, 41(6): 1301-1310.

[13] PIETIK?INEN J, KIIKKIl? O, FRITZE H. Charcoal as a habitat for microbes and its effect on the microbial community of the underlying humus., 2000, 89(2): 231-242.

[14] RIVERA-UTRILLA J, BAUTISTA-TOLEDO I, FERRO-GARCIA M A, MORENO-CASTILLA C. Activated carbon surface modifications by adsorption of bacteria and their effect on aqueous lead adsorption., 2001, 76(12): 1209-1215.

[15] WARNOCK D D, LEHMANN J, KUYPER T W, RILLIG M C.Mycorrhizal responses to biochar in soil – concepts and mechanisms., 2007, 300 (1/2): 9-20.

[16] KOLB S E, FERMANICH K J, DOMNBUSH M E. Effect of charcoal quantity on microbial biomass and activity in temperate soils., 2009, 73(4): 1173-1181.

[17] 顏永毫, 王丹丹, 鄭紀勇. 生物炭對土壤N2O和CH4排放影響的研究進展. 中國農學通報, 2013, 29(8): 140-146.

YAN Y H, WANG D D,ZHENG J Y. Advances in effects of biochar on the soil N2O and CH4 emissions., 2013, 29(8): 140-146. (in Chinese)

[18] LEHMANN J, RILL M C, THIES J, MASIELLO C A, HOCKADAY W C, CROWLEY D. Biochar effects on soil biota – A review., 2011, 43 (9):1812-1836.

[19] O'NEILL B, GROSSMAN J, TSAI M T, GOMES J E, LEHMANN J, PETERSON J, NEVES E, THIES J E. Bacterial community composition in Brazilian Anthrosols and adjacent soils characterized using culturing and molecular identification., 2009, 58(1): 23-35.

[20] FIERER N, SCHIMEL J P, HOLDEN P A. Variations in microbial community composition through two soil depth profiles., 2003, 35(1): 167-176.

[21] 潘全良, 宋濤, 陳坤, 徐曉楠, 彭靖, 戰(zhàn)秀梅, 王月, 韓曉日. 連續(xù)6年施用生物炭和炭基肥對棕壤生物活性的影響. 華北農學報, 2016, 31(3): 225-232.

PAN Q L, SONG T, CHEN K, XU X N, PENG J, ZHAN X M, WANG Y, HAN X R. Influences of 6-year application of biochar and biochar-based compound fertilizer on soil bioactivity on brown soil., 2016, 31(3): 225-232. (in Chinese)

[22] BOSSIO D A, SCOW K M. Impacts of carbon and flooding on soil microbial communities: Phospholipid fatty acid profiles and substrate utilization patterns., 1998, 35(3): 265-278.

[23] 齊鴻雁, 薛凱, 張洪勛. 磷脂脂肪酸譜圖分析方法及其在微生物生態(tài)學領域的應用. 生態(tài)學報, 2003, 23(8): 1576-1582.

QI H Y, XUE K, ZHANG H X. Phospholipid fatty acid analysis and its applications in microbial ecology., 2003, 23(8): 1576-1582. (in Chinese)

[24] SCHNECKER J R, WILD B, FUCHSLUEGER L, RICHTER A. A field method to store samples from temperate mountain grassland soils for analysis of phospholipid fatty acids., 2012, 51(8): 81-83.

[25] FROSTEG?R A, B??TH E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil., 1996, 22(1): 59-65.

[26] OLSSON P A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil., 1999, 29(4): 303-310.

[27] HILL G T, MITKOWSKI N A, ALDRICH-WOLFE L, EMELE L R, JURKONIE D D, FICKE A, MALDONADO-RAMIREZ S, LYNCH S T, NELSON E B. Methods for assessing the composition and diversity of soil microbial communities., 2000, 15(1): 25-36.

[28] SUUTARI M, LAAKSO S. Microbial fatty acids and thermal adaptation., 1994, 20(4): 285-328.

[29] KIMETU J M, LEHMANN J, KRULL E, SINGH B, JOSEPH S. Stability and stabilisation of biochar and green manure in soil with different organic carbon contents., 2010, 48(7): 577-585.

[30] BAGREEV A, BANDOSZ T J, LOCKE D C. Pore structure and surface chemistry of adsorbents obtained by pyrolysis of sewage sludge-derived fertilizer., 2001, 39(13): 1971-1979.

[31] CAO X, HARRIS W. Properties of dairy-manure-derived biochar pertinent to its potential use in remediation., 2010, 101(14): 5222-5228.

[32] SCHMIDT M W I, NOACK A G. Black carbon in soils and sediments: Analysis, distribution, implications, and current challenges., 2000, 14(3): 777-793.

[33] YAO H, HE Z, WILSON M J, CAMPBELL C D. Microbial biomass and community structure in a sequence of soils with increasing fertility and changing land use., 2000, 40(3): 223-237.

[34] MARSCHNER P, KANDELER E, MARSCHNER B. Structure and function of the soil microbial community in a long-term fertilizer experiment., 2003, 35(3): 453-461.

[35] INGWERSEN J, POLL C, STRECK T, KANDELER E. Micro-scale modelling of carbon turnover driven by microbial succession at a biogeochemical interface., 2008, 40(4): 864-878.

[36] JIN H. Characterization of microblal life colonizing biochar and biochar-amended soils. Ithaca: Cornell University, 2010.

[37] 李新, 焦燕, 楊銘德. 用磷脂脂肪酸(plfa)譜圖技術分析內蒙古河套灌區(qū)不同鹽堿程度土壤微生物群落多樣性. 生態(tài)科學, 2014, 33(3): 488-494.

LI X, JIAO Y, YANG M D. Microbial diversity of different saline-alkaline soil analyzing by PLFA in the Hetao area of inner Mongolia., 2014, 33(3): 488-494. (in Chinese)

[38] FTDE V, HOFFLAND E, NVAN E, BRUSSAARD L, BLOEM J. Fungal/bacterial ratios in grasslands with contrasting nitrogen management., 2006, 38(8): 2092-2103.

[39] FROSTEG?RD ?, B??THE, TUNLIO A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis., 1993, 25(6): 723-730.

[40] MCKINLEY V L, PEACOCK A D, WHITE D C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils., 2005, 37(10): 1946-1958.

[41] MARSCHNER P, YANG C H, LIEBEREI R, CROWLEY D E. Soil and plant specific effects on bacterial community composition in the rhizosphere., 2001, 33(11): 1437-1445.

[42] 岳琳艷, 鄭俊強, 韓士杰, 楊建華, 耿世聰, 陳志杰, 張雪, 谷越. 長白山溫帶森林不同演替階段土壤化學性質及微生物群落結構的變化. 生態(tài)學雜志, 2015, 34(9): 2590-2597.

YUE L Y, ZHENG J Q, HAN S J, YANG J H, GENG S C, CHEN Z J, ZHANG X, GU Y. Soil chemical properties and microbial community structure at different succession stages of temperate forest in Changbai Mountains., 2015, 34(9): 2590-2597. (in Chinese)

（責任編輯 李云霞）

Effects of Biochar and Biochar-based Fertilizer on Soil Microbial Community Structure

CHEN Kun, XU XiaoNan, PENG Jing, FENG XiaoJie, LI YaPeng, ZHAN XiuMei, HAN XiaoRi

(College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University/National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, Shenyang 110866)

【Objective】Microbes play the key role of switcher in soil nutrient cycling, the aim of this paper was to study the effects of soil microbial community structure by long-term fertilization of biochar and biochar-based fertilizer, and to provide theory reference on reasonable administration of different organic fertilizers, contrasting with traditional organic fertilizer (corn straw and piggery manure compost) in the meantime. 【Method】 This research was based on the long-term experiment of soil improvement of brown soil in Shenyang agricultural university (began in 2009). The changes of soil physic-chemical properties, soil microbial community structure and their relationship by long-term organic fertilizer plus NPK fertilization were studied by PLFA and correlatively analysis. Soil samples were collected from treatments as farmland with biochar-based compound fertilizer (BF) alone and farmland with piggery manure compost (PMC), corn straw-returning (CS), biochar (BIO) combination of NPK fertilizer, respectively. 【Result】Soil pH of PMC and BF were higher than BIO significantly; total N (TN) of PMC was significantly higher than BF and CS, which of BIO had no significant difference with PMC; soil organic matter (SOM) of PMC was significantly higher than that of BF and BIO; moisture content (MC) of PMC was the highest of all treatments; total K (TK) of all treatments had no significant difference. Total PLFAs of PMC was significantly higher than other treatments, but there were no significant differences among others; bacteria PLFAs of PMC was the highest of all treatments, which of BF was significantly lower than BIO and CS; fungi, gram-positive, gram-negative PLFAs of PMC were significantly higher than BIO, which of BF had no significant difference with PMC; actinomyces PLFAs of PMC was higher than CS significantly, there were no significant differences between BIO and BF. The result of analysis showed that Shannon-Winner richness index () and the fungi/bacteria PLFAs ratio of BF was higher than BIO significantly, the gram- positive/gram-negative PLFAs ratio of BF and PMC were lower than BIO significantly. The result of redundancy analysis (RDA) showed that microbial PLFA was significantly influenced (<0.01) by soil pH, TN and SOM, and significantly influenced (<0.05) by MC and TK.【Conclusion】Soil physico-chemical properties were obvious improved by long-term fertilization of biochar and biochar-based compound fertilizer. Compared to PMC, farmland with BIO was bad for the growth of fungi and gram-negative microbe, and farmland with BIO and BF had different effects on soil microbial community structure, namely, farmland with BIO could increase the biomass of bacteria, while farmland with BF could increase the fungi/bacteria ratio and the diversity of soil microbial community structure. Soil pH, TN, SOM, MC and TK were the important factors which influence the soil microbe community structure in this study in the order.

biochar; biochar-based compound fertilizer; PLFA; community structure; soil microbe

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.011

2017-06-27；

2017-10-12

國家自然科學基金（41201283）、國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303095-15）、國家科技支撐計劃（2015BAD23B05）

陳坤，E-mail：chenkun083@163.com。通信作者戰(zhàn)秀梅，E-mail：xiumeizhan@163.com