絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1在糖尿病大鼠腎組織細胞外基質重構中的作用

王麗暉，吳廣禮，林 靜，黃旭東，楊新軍，汪晶華，陳云爽，趙 維

腎小球硬化是糖尿病腎病(DN)的基本病理改變，細胞外基質(ECM)重構是導致腎小球硬化的主要原因之一[1]。高糖狀態下蛋白質非酶糖化增高，腎臟血流動力學紊亂、細胞增殖和凋亡及細胞通路的激活等參與了DN腎小球硬化的發生和發展[2]。研究表明，絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路的激活，尤其是p38 MAPK信號轉導蛋白活化后，可以激活多種核轉錄因子，影響目的基因表達，在一定程度上加速了DN的病變過程[3]。有關p38 MAPK信號通路在DN發病機制中的研究較多，但其在DN腎小球硬化中的表達如何調整，受何種因素調節，目前尚未有進一步的研究。絲裂原活化蛋白激酶磷酸-1(MKP-1)可通過使MAPK脫磷酸化進而使MAPK滅活，是MAPK信號通路的特異性負性調節因子[4]。在DN的ECM重構中MKP-1的作用，和其與p38 MAPK相互作用，目前尚不得知。本研究擬通過糖尿病大鼠腎組織中MKP-1蛋白及mRNA的表達情況，觀察MKP-1與p38 MAK信號轉導途徑之間的相互作用，以揭示DN時ECM重構可能發生的機制，為進一步防治DN提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠60只，河北省實驗動物中心提供，許可證號：1607934。1～12周齡，體重120～150 g，性周期4～5 d。飼養條件：按性周期一致性原則，每3只合并一籠，室溫21～22℃，濕度67%～75%，光照比例1:1。

1.2實驗儀器和試劑 鏈脲佐菌素(STZ，sigma公司，美國)；兔抗大鼠MKP-1和鼠抗大鼠p-p38 MAPK 購自美國Santa Cruz 公司；兔抗大鼠纖維粘連蛋白(Laminin，LN)和小鼠抗大鼠纖維粘連蛋白(Fibronectin，FN)均購自美國Neomarker 公司；免疫組化試劑盒(北京中山生物技術有限責任公司)；考馬斯亮藍試劑盒購自南京建成生物工程研究所；聚偏二氟乙烯膜( PVDF)購自美國merckmillipor公司； RT-PCR試劑為美國Promega 公司；Trizol購自美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.3實驗方法

1.3.1糖尿病腎病大鼠模型的構建：按65 mg/kg腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(STZ，溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液， PH=4.5)建立糖尿病模型，48 h后大鼠尾尖取血測定血糖，取尿測尿糖。血糖≥16.7 mmol/L，尿糖3+～4+者確定為建模成功。建模成功的大鼠隨機分為1、2、4、8和12周組，每組10只，實驗觀察期間大鼠自由進食飲水，不使用降糖藥物和胰島素。另選取10只大鼠為正常對照組，只注射相同體積的枸櫞酸緩沖液(pH=4.5、0.1 mol/L)。

1.3.2腎組織標本收集：糖尿病模型組制模成功后1、2、4、8、12周分別處死動物，切取腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，留取部分腎組織迅速置于-70℃液氮中提取RNA和蛋白質，留作反轉錄聚合鏈連反應(RT-PCR)和Western實驗檢測；部分置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液(0.01 mol/L PBS 配制)進行固定，留作常規腎臟病理和免疫組化檢測。

1.3.3免疫組化染色檢測腎皮質MKP-1、p-p38 MAPK和LN的表達：用SP法(鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶聯結法)，切片厚4 μm，常規脫蠟水化，一抗為免抗鼠MKP-1和LN多克隆抗體(1∶50稀釋)，鼠抗p-p38 MAPK單克隆抗體(1∶100稀釋)，二抗為生物素化羊抗兔或鼠IgG(1∶100稀釋)，以PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，光鏡觀察陽性信號，陽性部位呈棕黃色。免疫組化結果應用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統進行分析，LN陽性結果胞質著色，分別測量出每個腎小球LN的著色陽性面積、積分光密度(IOD)和腎小球面積，以前兩個參數與腎小球面積比表示該成分的相對含量和表達強度。p-p38 MAPK、MKP-1等胞核著色的免疫組化結果檢測每個腎小球視野內陽性胞核細胞數與所有腎小球細胞數之比，作為陽性百分比。每組分析6個標本，每個標本切片分析20個完整的腎小球，20個腎小球均值代表一只大鼠某種成分在腎小球中的相對含量和表達強度。20個腎小球“陽性百分比”代表一只大鼠某種成分在腎小球中的表達，以IOD表示其表達強度。

1.3.4Western blotting檢測腎皮質細胞MKP-1和p38 MAPK的活性：取-70℃保存的腎皮質約100 mg，加入預冷的蛋白裂解液0.5 ml。取100 μg蛋白加入上樣緩沖液，應用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。電泳后轉PVDF膜,分別與兔抗大鼠MKP-1和p-p38MAPK多克隆抗體(1∶100)，4℃ 過夜后，再度洗膜后加入1∶2500稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，37℃，2 h。洗膜后加增強化學發光(ECL, Santa Cruz公司) 試劑,將PVDF膜放入X光片暗盒,壓片,顯影,定影。用美國Kodak公司1D數碼成像分析系統軟件對Western條帶進行相對定量分析。

1.3.5RT-PCR檢測腎皮質MKP-1和FN mRNA的表達：采用Trizol提取腎皮質RNA，應用紫外可見分光光儀測定RNA的純度和含量。取總RNA 2 μg作為模板，在反轉錄酶(US)催化下合成cDNA，以適量cDNA 為模板在Taq DNA聚合酶催化下在聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀進行PCR擴增。MKP-1，FN及GAPDH引物均由北京奧科生物工程有限公司合成，使用的基因引物如下：MKP-1 F：5'- ACA GGG CAG AAG GGA AAG GAC -3'， R：5' - GCT GAA AGC CTG CTC TGG GTC -3' 產物：263bp；FN：F:5′CTGAACCAGCCTACGGATGACT3′R：5′CCGTCGTCATAACACGTTGCT3′產物305b；GAPDH： F：5′TATCGGACGCCTGGTTAC3′R：5′CTGTGCCGTTGAACTTGC3′ 產物140bp。PCR反應條件：94℃，5 min；95℃，1 min；采用退火溫度分別為55.9℃、54.9℃和56.9℃，1 min；72℃，1 min；擴增32個循環，最后72℃，10 min。取5ul PCR產物在2%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察條帶情況。應用凝膠圖像分析系統(UVP GD S800,U S) Labworks 4.5軟件測定IOD,并以GAPDH基因表達量為內參照，以目的產物與GAPDH的積分光密度比值表示mRNA相對含量。

2 結果

2.1免疫組化檢測結果 MKP-1主要在腎小球的內皮細胞、系膜細胞及腎小管上皮細胞的胞核中表達，在對照組腎小球和腎小管的細胞核著色較強，在糖尿病組表達明顯減少(見圖1)。p38 MAPK主要表達在腎小球內皮細胞、系膜區及臟層上皮細胞的胞質內，偶有近端和遠端腎小管上皮細胞表達，與對照組比較糖尿病組的表達較強(見圖2)。LN的陽性染色主要分布于毛細血管基膜、腎小球囊壁和腎小管基膜和系膜區，在腎間質中也有表達，與對照組比較，糖尿病組表達增強(見圖3)。圖像分析結果表明，與對照組比較，糖尿病組MKP-1表達在1～8周表達量明顯減少(P<0.01)；第12周表達量與對照組無統計學差異(P>0.05)。糖尿病組p38 MAPK在 1～8周時表達增強(P<0.01)，在 12周時與對照組比較無統計學差異(P<0.01)。LN在糖尿病組的表達從4～12周均明顯增高(P<0.01)。見表1。

圖1免疫組化檢測MKP-1在兩組大鼠腎組織中的表達(DAB×400)

圖2免疫組化檢測p-p38MAPK在兩組大鼠腎組織中的表達(DAB×200)

圖3免疫組化檢測Lamain在兩組大鼠腎組織中的表達(DAB×400)

表1 兩組大鼠腎組織中p-p38 MAPK 、MKP-1和LN的表達

注：p-p38 MAPK為磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶，MKP-1為絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1，LN為層粘連蛋白；與對照組相比，bP<0.01

2.2Western blotting檢測結果 糖尿病組1～8周MKP-1蛋白的表達量低于對照組(P<0.01)，但在糖尿病12周時與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。p38蛋白激酶的活性從糖尿病1周時開始升高，在4、8周時達到高峰(P<0.01)；在12周時與對照組差異無統計學意義(P≥0.05)。見圖 4，表2。

圖4兩組大鼠腎皮質P-p38MAPK和MKP-1的動態變化

1代表對照組 ，2、3、4、5、6代表糖尿病組 1、2、4、8、12周

表2 兩組大鼠腎皮質中MKP-1和p-p38 MAPK的表達

注：MKP-1為絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶，p-p38 MAPK為磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶；與對照組相比，bP<0.01

2.3RT-PCR檢測結果 MKP-1 mRNA的表達在糖尿病1-8周時低于對照組(P<0.01)，12周時與對照組無統計學差異(P>0.05)。與對照組比較，FN mRNA在糖尿病第2周開始升高，隨著時間的延長其表達越來越強(P<0.01)。而各磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的表達幾乎保持恒定(表3，圖5)。

表3 兩組大鼠腎皮質中MKP-1和FN mRNA的表達

注：MKP-1為絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶，FN為纖維粘連蛋白；與對照組相比，bP<0.01

圖5兩組大鼠腎皮質中MKP-1和FNmRNA的動態變化

3 討論

糖尿病腎病時ECM重構是糖尿病腎小球硬化的基礎；既往研究表明，高糖有可能是導致ECM重構的直接因素；血流動力學異常、氧化應激、細胞因子等均可導致ECM重構的發生[5]。MAPK家族在各種刺激因子的作用下，通過使核轉錄因子磷酸化，參與細胞增殖、分化、轉化及凋亡的調節；p38 MAPK被激活后進入細胞核，使核轉錄調節因子活化，從而調節相應目的基因轉錄，在一定程度上導致和加速了DN的發生、發展[6]。認為p38 MAPK是細胞信息傳遞的交匯點或共同通路[7]。本研究結果顯示，糖尿病組p38 MAPK的磷酸化水平在DM 1周時開始升高，在4～8周時達到高峰，在DM 12周時其活性與對照組無明顯差異。而作為ECM主要成分的LN在糖尿病組從4～12周表達明顯增高，并隨病程的延長而表達增強。提示p38蛋白激酶活化后，可以使LN的表達明顯增強，p38MAPK通路在糖尿病大鼠的ECM的重構中發揮一定作用。我們既往研究發現[8]，體外培養的大鼠系膜細胞在高糖狀態下p38 MAPK信號轉導蛋白磷酸化水平提高，可以上調結締組織生長因子(CTGF)mRNA的表達，從而刺激細胞上清液中FN和LM的分泌。Rane等[9]觀察了體外培養的腎小管上皮細胞，在高糖狀態下凋亡基因增強，凋亡細胞增多，提示p38 MAPK信號轉導通路不僅在腎小球系膜細胞中發揮作用，同時參與腎小管上皮細胞的凋亡過程。目前針對DN的治療主要是控制血壓、控制血糖、改善腎臟微循環等，但也難以逆轉DN的進程。所以選擇抑制p38 MAPK信號轉導通路的激活，有可能在糖尿病腎病的預防和治療中發揮一定作用。

MKP-1是MAPKs的天然負性調節因子，對MAPKs 的去磷酸化作用有重要的意義[10]。MAPKs 調節位點中保守的蘇氨酸或酪氨酸基團可被雙特異性蛋白激酶磷酸化激活，而雙特異性蛋白磷酸酶可使同樣位點的蘇氨酸或酪氨酸基團去磷酸化，從而使活化的MAPKs主要被蛋白磷酸酶去磷酸化而失活[11]。Kato等[12]觀察心房利鈉肽(ANP)對體外培養的腎小球足細胞的影響時發現，ANP可增加MKP-1的活性，同時阻斷p38 MAPK的活性，導致凋亡基因Bax和 Bax/Bcl2的表達下降。p38 MAPK的阻斷劑FR167653，可以降低血壓，降低尿蛋白排出，減輕節段硬化，足細胞受損和細胞凋亡。因此，ANP通過阻斷p38 MAPK通路，增加MKP-1的活性起到腎臟保護功能。蛋白磷酸酶的活性是蛋白激酶活性的100～1000 倍，故將注意力放在蛋白磷酸酶的生理作用上。一般認為MKP-1 的特異性選擇底物是p38，在一些情況下也可能是JNK 或ERK[13]。

本實驗結果顯示，糖尿病模型大鼠在注射鏈脲佐菌素1周后，MKP-1活性及mRNA 表達較對照組下降，并持續到第8周，在第12周時其蛋白及mRNA的表達下降。而p38 MAPK的活性在1周時開始升高，FN、LN水平在第4周升高，p38 MAPK的活性及FN、LN的表達升高持續到12周。MKP-1的活性下降早于FN和LN。提示糖尿病狀態下，大鼠腎組織MKP-1的蛋白和mRNA的表達均下降，而且MKP-1活性的下降晚于p38 MAPK活性的上升，提示高糖可以使MKP-1的合成減少，降解增加。文獻報道，高糖培養大鼠的腎小球系膜細胞MKP- 1 蛋白的表達明顯下降，而p38 MAPK 活性增加[14]。提示糖尿病腎病時p38 MAPK 活化是由于磷酸化增強、MKP- 1 的脫磷酸化減弱所致。

一般認為， MKP-1是一種細胞核酶，能快速調整MAPK的去磷酸化，短時間內發揮作用。Fang等[4]觀察提示越早期應用胰島素可使MKP-1表達增加，降低p38 MAPK活性，有效減輕腎臟肥大的發生。Gorostizaga等[15]曾發現當近端腎小管上皮細胞暴露于高濃度白蛋白培養液下， MKP-1水平在15 min即快速升高，在6 h時達到頂峰，隨即下降。尿白蛋白通過基因轉錄的激活可使MKP-1 mRNA水平短暫升高(1 h為對照組的3倍)。尿中白蛋白不僅觸發MAPK的活化也緊緊地上調MKP-1表達。所以推測MKP-1 的短半衰期與MAPK對其磷酸化作用[16]。Winiarska等[17]研究結果提示細胞活動中MKPs 的表達是繼發于MAPK 激活后，即MKPs 的表達是細胞對MAPK 通路激活的一種反饋。MKP-1在低滲應激下可激活p38 MAPK， 誘導β和γ-腎小管上皮細胞鈉通道蛋白的表達。PD98059作為MEK抑制劑，可以誘導MKP-1的表達從而抑制p38MAPK的活化。本實驗結果也表明，模型大鼠在第2周時p38 MAPK的活性表達增強，MKP-1的蛋白表達下降，提示MKP-1對p38 MAPK的負調節是繼發于p38 MAPK激活后，同時這種磷酸化作用可以抑制蛋白酶對MKP-1 的降解，從而增強其穩定性，MKP-1 表達也受到MAPKs 的負反饋調節。MKP-1 與MAPKs 之間相互作用，相互影響。

綜上所述， MKP-1 是p38 MAPK 的負性調節因子，可以對p38 MAPK 的主要通路進行調節，并抑制其下游反應。激活后可使糖尿病大鼠腎組織的細胞外基質的含量降低，在DN的ECM重構中發揮保護作用，可減輕DN病理改變，延緩DN發生和發展。如果能發現能使提高MKP-1 的表達的藥物，可對抗高糖對細胞外基質重構的影響，從而為臨床治療DN提供理論基礎。

[]

[1] Soni H, Adebiyi A. Urotensin II-induced store-operated Ca2+entry contributes to glomerular mesangial cell proliferation and extracellular matrix protein production under high glucose conditions[J].Sci Rep, 2017,22,7(1):18049.

[2] Wang S, Zhao X, Yang S,etal. Salidroside alleviates high glucose-induced oxidative stress and extracellular matrix accumulation in rat glomerular mesangial cells by the TXNIP-NLRP3 inflammasome pathway[J].Chem Biol Interact, 2017,278(1):48-53.

[3] Wang R M， Wang Z B, Wang Y，etal. Swiprosin-1 Promotes Mitochondria-Dependent Apoptosis of Glomerular Podocytes via p38 MAPK Pathway in Early-Stage Diabetic Nephropathy[J]Cell Physiol Biochem, 2018,45(3):899-916.

[4] Fang D,Guan H,Liu J,etal. Early intensive insulin therapy attenuates the p38 pathway in the renal cortex and indices of nephropathy in diabeticrats[J].Endocr J, 2012,59(1):81-90.

[5] Li J, Bao L, Zha D,etal. Oridonin protects against the inflammatory response in diabetic nephropathy by inhibiting the TLR4 /p38 -MAPK and TLR4/NF-κB signaling pathways[J].Int Immunopharmacol, 2017,55(1):9-19.

[6] 王麗暉，段惠軍，史永紅，等.p38 絲裂原活化蛋白激酶在糖尿病大鼠腎組織細胞外基質重構中的作用[J].解放軍醫學雜志,2005,30(4)：310-313.

[7] Yeda X,Shaoqing L,Yayi H,etal. Dexmedetomidine protects against renal ischemia and reperfusion injury by inhibiting the p38-MAPK/TXNIP signaling activation in streptozotocin induced diabeticrats[J].Acta Cir Bras，2017,32(6):429-439.

[8] 王麗暉,段惠軍，吳廣禮，等.高糖誘導大鼠系膜細胞CTGF mRNA的表達及機制探討[J].中國病理生理雜志,2009,25(8):1644-1646.

[9] Rane M J, Song Y, Jin S,etal. Interplay between Akt and p38 MAPK pathways in the regulation of renal tubular cell apoptosis associated with diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2010,298(1):F49-61.

[10] Thiel G, R?ssler O G. Resveratrol stimulates AP-1-regulated gene transcription[J].Mol Nutr Food Res, 2014,58(7):1402-1413.

[11] Tsai S F, Hsieh C C, Wu M J,etal. Novel findings of secreted cyclophilin A in diabetic nephropathy and its association with renal protection of dipeptidyl peptidase 4 inhibitor[J].Clin Chim Acta, 2016,463(1):181-192.

[12] Kato Y,Mori K, Kasahara M,etal. Natriuretic peptide receptor guanylyl cyclase-A pathway counteracts glomerular injury evoked by aldosterone through p38 mitogen-activated protein kinase inhibition[J].Sci Rep, 2017,7:44642.

[13] Akhtar S, Al-Zaid B, El-Hashim A Z,etal. Impact of PAMAM delivery systems on signal transduction pathways in vivo: Modulation of ERK1/2 and p38 MAP kinase signaling in the normal and diabetic kidney[J].Int J Pharm, 2016,514(2):353-363.

[14] Jung Y J, Lee A S, Nguyen-Thanh T,etal. SIRT2 Regulates LPS-Induced Renal Tubular CXCL2 and CCL2 Expression[J].J Am Soc Nephrol, 2015,26(7):1549-1560.

[15] Gorostizaga A, Mori Sequeiros García M M,etal. Modulation of albumin-induced endoplasmic reticulum stress in renal proximal tubule cells by upregulation of mapk phosphatase-1[J].Chem Biol Interact, 2013,206(1):47-54.

[16] Zhou X, Liu R, Duan S,etal. High Glucose Enhances oxLDL-Induced Apoptosis in Human Renal Proximal Tubular Epithelial Cells Largely via Inducing Lectin-Like ox-LDL Receptor-1[J].Pharmacology, 2016,98(1-2):20-28.

[17] Winiarska K, Jarzyna R, Dzik J M,etal. ERK1/2 pathway is involved in renal gluconeogenesis inhibition under conditions of lowered NADPH oxidase activity[J].Free Radic Biol Med, 2015,81:13-21.