不同居群新疆野蘋果生理響應差異與抗寒性的關系

王澤華 ，秦 偉

（1.新疆農業大學 林業研究所，新疆 烏魯木齊 830052；2.湖南省農業委員會 湖南農業雜志社，湖南 長沙 410005）

蘋果具有很高的經濟價值，也是重要的水果資源、觀賞資源及砧木資源，而中國的蘋果產量和栽培面積均居世界首位[1]。在蘋果屬植物中，與栽培蘋果親緣關系最近的野生種是新疆野蘋果[2-4]，Richards等人研究認為，中亞地區是栽培蘋果的起源中心，他們提出，新疆野蘋果是栽培蘋果的祖先種[5-6]。新疆野蘋果是第三紀孑遺物種[7]，主要分布在天山山脈，包括中國的新疆維吾爾自治區和哈薩克斯坦的阿拉木圖州與塔爾迪庫爾干州以及吉爾吉斯斯坦的伊塞克湖州等地區[2]。我國最常用的蘋果砧木分別為山定子、西府海棠和新疆野蘋果，其中的山定子抗逆性好但不耐鹽堿，西府海棠親和力好但抗逆性不如新疆野蘋果，而新疆野蘋果具有抗寒性、抗旱性、抗鹽堿、抗病蟲[9]多種優良的抗逆性狀[8]，且其與栽培蘋果有較好的親和力，時至今日，新疆野蘋果已經成為我國西部地區的重要砧木資源[10]。目前，對植物生理生化指標與抗寒性關系的研究報道有很多[11-14]，但有關低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果生理響應差異的研究報道卻較少，在之前的研究中，本課題組研究了低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果休眠枝條的生理響應差異[15-16]。為給新疆野蘋果優良抗寒種質資源的篩選提供參考依據，本研究以不同居群新疆野蘋果實生苗的葉片為試材，對其低溫生理響應差異進行了比較分析，現將研究結果分析報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

2015年12月下旬分別在新疆維吾爾自治區伊犁州新源縣的阿勒馬勒鄉、鞏留縣莫乎爾鄉、霍城縣大西溝鄉、托里縣多拉特鄉、額敏縣霍吉爾特鄉等5個新疆野蘋果自然居群采樣，在每個自然居群內隨機抽樣帶回實驗室，待果實后熟后剝取種子，次年1月每個居群各取200粒種子進行層積處理，4月將層積處理好的種子播種于營養袋中，每袋播種4粒種子，均置于新疆農業大學校內實驗田中讓其自然生長，8月選取生長良好且無病蟲害的植株進行低溫處理，處理溫度分別設為25（即室溫，作為對照CK）、10、5、0、-5和-10 ℃，降溫的速度和解凍時溫度的回升速度均為4 ℃/h，降溫時溫度達到處理溫度后維持24 h，然后解凍，達到室溫后取出靜置1 h，取中上部的葉片以測定相關指標。

1.2 方 法

采用電導法測定相對電導率，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，采用茚三酮顯色法測定脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛含量，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，采用NBT光化還原法測定SOD活性，采用愈創木酚法測定POD活性，采用紫外吸收法測定CAT活性[17-18]。所有指標的測定均設3次重復。

1.3 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行數據處理與顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同低溫脅迫對不同居群新疆野蘋果相對電導率的影響

不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果的相對電導率如圖1 所示。由圖1可知，在低溫脅迫下，不同居群新疆野蘋果的相對電導率均隨著處理溫度的下降而增加，但增加幅度不同。在處理溫度降至0 ℃前，不同居群新疆野蘋果相對電導率的增勢均較緩；當溫度降至0 ℃時，新源縣、鞏留縣和霍城縣野蘋果相對電導率的增幅均較大，均超過10%，而托里縣和額敏縣野蘋果的相對電導率在-5 ℃時才有較大增幅，這說明在處理溫度降到0 ℃時，新源縣、鞏留縣和霍城縣野蘋果細胞膜均受到明顯傷害，而在處理溫度降到-5 ℃時，托里縣和額敏縣野蘋果細胞膜才受到明顯傷害。顯著性差異分析結果表明，在處理溫度降到5 ℃后，新源縣、鞏留縣和霍城縣野蘋果的相對電導率一直極顯著高于托里縣和額敏縣野蘋果的相對電導率（P＜0.01）。

2.2 不同低溫脅迫對不同居群新疆野蘋果枝條可溶性糖含量的影響

不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的可溶性糖含量如圖2 所示。由圖2可知，在低溫脅迫下，不同居群新疆野蘋果枝條的可溶性糖含量均呈先增后降的變化趨勢：不同居群新疆野蘋果的可溶性糖含量在處理溫度降至0 ℃時均達到最大值，托里縣、額敏縣、鞏留縣、霍城縣、新源縣野蘋果枝條的可溶性糖含量最大值由高到低依次為4.55%、4.33%、3.85%、3.72%、3.47%；與對照（CK）比較，托里縣、額敏縣、鞏留縣、新源縣、霍城縣野蘋果枝條可溶性糖含量達到最高時的增量由多到少分別為2.13%、2.01%、1.11%、0.87%、0.84%。顯著性差異分析結果表明，當處理溫度為0 ℃時，托里縣野蘋果枝條的可溶性糖含量顯著高于額敏縣野蘋果（P＜0.05），托里縣和額敏縣野蘋果枝條的可溶性糖含量差極顯著高于其他3個居群（P＜0.01），其他3個居群間的含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果的相對電導率Fig.1 Relative electrical conductivity of different Malus sieversii populations under different treatment temperatures

圖2 不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的可溶性糖含量Fig.2 Soluble sugar content of different Malus sieversii populations under different treatment temperatures

2.3 不同低溫脅迫對不同居群新疆野蘋果枝條脯氨酸含量的影響

不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的脯氨酸含量如圖3 所示。由圖3可知，在低溫脅迫下，不同居群新疆野蘋果的脯氨酸含量均隨處理溫度的下降而升高。與對照（CK）比較，不同居群新疆野蘋果的脯氨酸含量達到最高值時的增量由多到少依次為：托里縣野蘋果（69.63 μg·g-1）、額敏縣野蘋果（52.69 μg·g-1）、鞏留縣野蘋果（41.51 μg·g-1）、霍城縣野蘋果（40.15 μg·g-1）、新源縣野蘋果（29.14 μg·g-1）。顯著性差異分析結果表明，在處理溫度降至0 ℃后，托里縣野蘋果的脯氨酸含量顯著高于新源縣野蘋果（P＜0.05），其余居群間的含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的脯氨酸含量Fig.3 Proline content of different Malus sieversii populations under different treatment temperatures

2.4 不同低溫脅迫對不同居群新疆野蘋果枝條丙二醛含量的影響

不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的丙二醛含量如圖4 所示。由圖4可知，在低溫脅迫下，不同居群新疆野蘋果枝條的MDA含量均呈現先升后降的變化趨勢，在處理溫度降至-5 ℃時均達到最大值，其由高到低依次為：鞏留縣野蘋果（46.02 μmol·g-1）、新源縣野蘋果（43.10 μmol·g-1）、霍城縣野蘋果（42.64 μmol·g-1）、額敏縣野蘋果（41.59 μmol·g-1）、托里縣野蘋果（39.22 μmol·g-1）。與對照（CK）比較，不同居群新疆野蘋果枝條的MDA含量達到最高時的增量由多到少依次為：新源縣野蘋果（33.81 μmol·g-1）、鞏留縣野蘋果（32.67 μmol·g-1）、霍城縣野蘋果（31.90 μmol·g-1）、額敏縣野蘋果（29.02 μmol·g-1）、托里縣野蘋果（27.45 μmol·g-1）。顯著性差異分析結果表明，當處理溫度為-5 ℃時，鞏留縣野蘋果枝條的MDA含量顯著高于托里縣野蘋果（P＜0.05），而其他居群間的含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的丙二醛含量Fig.4 MDA of different Malus sieversii populations under different treatment temperatures

2.5 不同低溫脅迫對不同居群新疆野蘋果枝條可溶性蛋白的影響

不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的可溶性蛋白含量如圖5 所示。由圖5可知，在低溫脅迫下，不同居群新疆野蘋果枝條的可溶性蛋白含量均隨著處理溫度的下降而升高。與對照（CK）比較，不同居群新疆野蘋果枝條的脯氨酸含量達到最高值時的增量由多到少依次為：托里縣野蘋果（5.84 mg·g-1）、額敏縣野蘋果（5.59 mg·g-1）、霍城縣野蘋果（4.64 mg·g-1）、鞏留縣野蘋果（4.58 mg·g-1）、新源縣野蘋果（4.33 mg·g-1）。顯著性差異分析結果表明，當處理溫度為-10 ℃時，托里縣野蘋果的可溶性蛋白含量極顯著低于新源縣、鞏留縣和霍城縣野蘋果（P＜0.01），而霍城縣野蘋果的可溶性蛋白極顯著高于其他4個居群（P＜0.01）。

圖5 不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的可溶性蛋白含量Fig.5 Soluble protein content of different Malus sieversii populations under different treatment temperatures

2.6 不同低溫脅迫對不同居群新疆野蘋果枝條SOD活性的影響

不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的SOD活性如圖6 所示。由圖6可知，在低溫脅迫下，不同居群新疆野蘋果的SOD活性均呈先增后降的變化趨勢，在處理溫度降至0 ℃時均達到最大值，這說明供試材料在溫度降至0 ℃前其細胞自身保護能力增強，而低于0 ℃這種保護能力則變弱。不同居群新疆野蘋果的SOD活性達到最高值時其由高到低依次為：托里縣野蘋果（180.59 U·g-1h-1）、額敏縣野蘋果（169.78 U·g-1h-1）、霍城縣野蘋果（160.40 U·g-1h-1）、鞏留縣野蘋果（155.87 U·g-1h-1）、新源縣野蘋果（126.57 U·g-1h-1）。與對照（CK）比較，不同居群新疆野蘋果的SOD活性達到最高時的增量由多到少依次為：托里縣野蘋果（149.16 U·g-1h-1）、額敏縣野蘋果（139.04 U·g-1h-1）、鞏留縣野蘋果（131.83 U·g-1h-1）、霍城縣野蘋果（129.54 U·g-1h-1）、新源縣野蘋果（90.38 U·g-1h-1）。顯著性差異分析結果表明，當處理溫度為0 ℃時，托里縣和額敏縣野蘋果的SOD活性均顯著高于新源縣野蘋果（P＜0.05），而在其他處理溫度下，各居群間的含量差異均不顯著（P＞0.05）。

2.7 不同低溫脅迫對不同居群新疆野蘋果枝條POD活性的影響

不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的POD活性如圖7 所示。由圖7可知，在低溫脅迫下，不同居群新疆野蘋果的POD活性均呈現先增后降的變化趨勢，在處理溫度降至-5 ℃時均達到最大值，這說明，新疆野蘋果在10～-5 ℃時細胞自身保護能力增強，而在低于-5 ℃時這種保護能力則變弱。不同居群新疆野蘋果枝條的POD活性達到最高值時其由高到低依次為：托里縣野蘋果（269.44 μg·mg-1）、額敏縣野蘋果（255.06 μg·mg-1）、鞏留縣野蘋果（231.92 μg·mg-1）、霍城縣野蘋果（186.79 μg·mg-1）、新源縣野蘋果（125.55 μg·mg-1）。與對照（CK）比較，不同居群新疆野蘋果的POD活性達到最高時的增量由多到少依次為：托里縣野蘋果（234.60 μg·mg-1）、額敏縣野蘋果（210.31 μg·mg-1）、鞏留縣野蘋果（176.24 μg·mg-1）、霍城縣野蘋果（125.81 μg·mg-1）、新源縣野蘋果（84.31 μg·mg-1）。顯著性差異分析結果表明，當處理溫度為-5 ℃時，托里縣和額敏縣野蘋果的POD活性均極顯著高于新源縣和霍城縣野蘋果（P＜0.01），鞏留縣野蘋果的POD活性極顯著高于新源縣野蘋果（P＜0.01）。

圖6 不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的SOD活性Fig.6 SOD of different Malus sieversii populations under different treatment temperatures

圖7 不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的POD活性Fig.7 POD of different Malus sieversii populations under different treatment temperatures

2.8 不同低溫脅迫對不同居群新疆野蘋果枝條CAT活性的影響

不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的CAT活性如圖8所示。由圖8可知，在低溫脅迫下，不同居群新疆野蘋果枝條的CAT活性均呈現先增后降的變化趨勢，在處理溫度降至0 ℃時均達到最大值，這說明不同居群新疆野蘋果在10～0 ℃時其細胞自身保護能力迅速增強，而低于0 ℃時這種保護能力則變弱。不同居群新疆野蘋果枝條的CAT活性最高值由高到低依次為：額敏縣野蘋果（192.22 U·g-1min-1）、托里縣野蘋果（176.74 U·g-1min-1）、霍城縣野蘋果（153.26 U·g-1min-1）、鞏留縣野蘋果（148.28 U·g-1min-1）、新源縣野蘋果（133.56 U·g-1min-1）。與對照（CK）比較，不同居群新疆野蘋果CAT活性達到最高值時的增量由多到少依次為：額敏縣野蘋果（151.50 U·g-1min-1）、托里縣野蘋果（136.52 U·g-1min-1）、鞏留縣野蘋果（108.90 U·g-1min-1）、新源縣野蘋果（102.89 U·g-1min-1）、霍城縣野蘋果（102.37 U·g-1min-1）。顯著性差異分析結果表明，當處理溫度為0 ℃時，托里縣和額敏縣野蘋果的CAT活性均極顯著高于其他3個居群（P＜0.01），鞏留縣野蘋果的CAT活性顯著高于新源縣野蘋果（P＜0.05），新源縣和霍城縣野蘋果的CAT活性之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖8 不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條的CAT活性Fig.8 CAT of different Malus sieversii populations under different treatment temperatures

2.9 不同低溫脅迫下不同居群新疆野蘋果枝條各抗寒指標的主成分分析

對不同居群新疆野蘋果枝條各個抗寒指標測定值進行了主成分分析（結果見表1），從中提取出2個主成分，其累計貢獻率為88.79%，包含了所測定的8個指標中的絕大部分信息，所以，可以利用這2個主成分對不同居群新疆野蘋果進行抗寒性評價。在主成分1中，各個指標作用由大到小依次是CAT活性、可溶性糖含量、相對電導率、脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、MDA含量和可溶性蛋白含量。

表2給出了不同居群新疆野蘋果休眠枝條在所提取的主成分中的得分，分值越高，說明其抗寒性越強，由此可以推測，不同居群新疆野蘋果的抗寒性由強到弱依次為：托里縣野蘋果、額敏縣野蘋果、鞏留縣野蘋果、霍城縣野蘋果、新源縣野蘋果。

表1 新疆野蘋果枝條各抗寒指標的主成分系數及貢獻率Table 1 The component coefficient of the cold resistance indexes and proportion of Malus sieversii

表2 不同居群新疆野蘋果主成分的得分Table 2 Factor scores of of Malus sieversii of different habitats

3 討 論

相對電導率已廣泛應用于植物抗寒性研究中，它能直觀顯示植物在低溫脅迫下細胞膜透性的變化情況[19-21]。植物遭受低溫傷害時，細胞的膜透性增大，進而導致生理代謝紊亂[22]。用相對電導率反映新疆野蘋果細胞質膜透性的變化情況，能直觀了解其受傷害的程度，推斷不同居群新疆野蘋果抗寒性的強弱順序，探究其抗寒性差異。

可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白均為植物體內重要的滲透調節物質。可溶性糖能通過滲透調節來增強細胞膜的穩定性[18]。研究中發現，不同居群新疆野蘋果枝條的可溶性糖含量均隨處理溫度的下降而呈先升高后下降的變化趨勢，表明新疆野蘋果的抗凍能力在低溫脅迫下先升高，但低溫脅迫到達一定程度后則會變低，這與王勇等人對核桃抗寒性的研究結果一致[23]。脯氨酸能夠增強植物的保水能力，從而增強植物的抗寒性[24]。研究中發現，不同居群新疆野蘋果枝條的脯氨酸含量均隨處理溫度的下降而上升，表明其在受到低溫脅迫時會調動內源物質來抵抗凍害，這與李建設等人對茄子幼苗抗寒性的研究結果一致[25]。可溶性蛋白不僅能降低植物細胞冰點，還能增加其水合度，增強其保水能力，減小細胞原生質受到脫水傷害[26]，徐小軍等人對甜瓜幼苗的研究結果表明，可溶性蛋白含量與試材的抗寒性呈正相關[27]。本研究結果表明，不同居群新疆野蘋果的可溶性蛋白含量均隨處理溫度的下降而上升，但上升幅度不同，表明其抗寒性存在差異，這與王依等對不同品種葡萄的研究結果一致[28]。

丙二醛是植物在受到低溫脅迫時膜脂過氧化作用的產物之一，其含量增加會破壞細胞膜系統，甚至導致細胞死亡[13,26]。本研究結果表明，不同居群新疆野蘋果的MDA含量均隨處理溫度的下降而呈現先升后降的變化趨勢，這與譚艷玲等人[29]對鐵皮石斛的部分研究結果相近。

植物在受到低溫脅迫時體內自由基和活性氧含量的增加會影響細胞膜系統的穩定性，最終導致膜結構被破壞，SOD、POD和CAT是植物體內的3種保護酶，都是酶促防御系統的重要組成部分，它們能維持膜的穩定，增強植物的抗寒性[30]。本研究中發現，不同居群新疆野蘋果的SOD、POD和CAT酶活性均隨處理溫度的下降而呈先升后降的變化趨勢，這表明，不同居群新疆野蘋果的保護酶均受到低溫的誘導，但處理溫度降至一定程度后，3種保護酶的活性均開始下降，這說明其保護能力開始變弱，這與令凡等人對油橄欖的研究結果一致[31]。武雁軍等人對厚皮甜瓜的研究結果表明，抗寒性強的品種其酶活性較高[14]。顯著性差異分析結果表明，不同居群新疆野蘋果的酶活性間有差異，因此可以通過不同居群新疆野蘋果3種酶活性的大小來判斷其抗寒性的強弱。

綜上所述，不同居群新疆野蘋果的抗寒性差異可以通過測定其相對電導率、可溶性糖含量、脯氨酸含量、MDA含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性和CAT活性來推測。但是，植物的抗寒性受到多種因素的影響，只分析單一指標來反映其抗寒性并不可靠，不能用某一個指標評價植物的抗寒性[12,32,33]。目前，本課題組在前期已經研究了不同居群新疆野蘋果葉片解剖結構的差異[8]、休眠枝條的生理響應差異[15-16]及與抗寒相關基因CBF1、CBF2、CBF3和CBF4的表達差異[34]，這幾個方面的研究結論均一致，且與本文的研究結論也一致，說明不同居群新疆野蘋果的抗寒性存在差異，也證實了研究結論的可靠性，但要深刻而準確地揭示不同居群新疆野蘋果的抗寒性差異，了解其差異產生的過程，還需在分子生物學層面進行更加深入的研究。

4 結 論

本研究對不同居群新疆野蘋果枝條的相對電導率、可溶性糖含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性和CAT活性進行了測定，結合主成分分析結果對其抗寒性進行了綜合評判，結果表明，不同居群新疆野蘋果的抗寒性由強到弱依次為：托里縣野蘋果、額敏縣野蘋果、鞏留縣野蘋果、霍城縣野蘋果、新源縣野蘋果。

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