烏飯樹果實提取物抗氧化活性研究

（贛南師范大學 生命與環境科學學院，江西 贛州 341000）

烏飯樹（又名南燭）Vaccinium bracteatumThunb.是杜鵑花科Ericaceae越桔屬Vaccinium的常綠灌木植物，目前仍處于野生狀態，主要廣泛分布于中國亞熱帶丘陵低山地區，包括臺灣省和華東、華中、華南和西南等地區，也是酸性土壤的指示植物。烏飯樹與藍莓是同一個屬的植物[1-2]，都屬于小漿果類；烏飯樹的果實酸甜可口，風味尤佳。我國民間用烏飯樹嫩葉水浸提液煮熟的米飯呈紫黑色，故稱其為“烏飯”，這是我國幾千年的傳統保健食品[3-4]。烏飯樹葉具有較強的清除氧自由基和清除羥自由基活性[5-8]，現代醫學和食品科學等學科關于烏飯樹葉的抗氧化活性物質的研究較多。魏國華等研究認為，烏飯樹葉富含濃縮型單寧、槲皮素等多酚類化合物[9-10]。這些酚類化合物具有較強的抗氧化功能，可清除羥自由基（DPPH）和氧自由基（-OH-）[11-12]，因為當DPPH溶液中加入自由基清除劑（抗氧化物質）時，DPPH加入自由基接受受試物的電子或者氫自由基而變成穩定的抗磁分子[13-14]。其次，在抗脂質過氧化的研究中發現，脂質一旦被氧化，就會產生脂質過氧化自由基，由此又影響到周圍的脂肪酸并產生新的脂質自由基，如此連鎖反應會持續下去，從而破壞細胞膜的脂質結構，甚至損壞蛋白質和核酸，導致細胞和組織病變。凌關庭等認為，抑制脂質過氧化的能力主要取決于“抗氧化物質”本身提供H＋的能力，烏飯葉的提取物（主要是多酚類抗氧化物質）都具有抗脂質自由基的能力[13-14]。因此，烏飯樹葉具有較強的抗疲勞及延緩衰老、抗貧血及增強機體免疫力、抗癌防癌、改善視網膜功能、治療糖尿病等功用[15-17]。但是，目前關于烏飯樹果實抗氧化物質及其抗氧化活性的研究報道較少。為給其功能性品種的進一步選育和有效利用打下理論基礎，對烏飯樹果實中抗氧化物質的提取、含量及抗氧化活性等方面進行了實驗研究，同時對不同地理區域的烏飯樹果實其抗氧化能力的地理差異進行了比較分析，現將研究結果分析報道如下。

1 取樣及樣地的自然條件

在江西的贛州和萍鄉、湖南瀏陽、江蘇宜興4個地點采集成熟的烏飯樹果實，每個地點各選取5個居群采樣，混合后稱取600 g作為這個采樣地點的測試樣品，取樣地點的自然條件見表1。在測試實驗過程中，每個地點的樣品重復測試2次。

表1 烏飯樹果實取樣地點及其自然地理氣候因子Table 1 Climates of geographic areas where samples of fruits were taken

2 測定方法

2.1 儀器與試劑

主要儀器為島津LC-10A高效液相色譜儀，DGU-14A 脫氣機，LC-10AT 二元泵，SIL-10AD自動進樣器，SPD-10AZ紫外檢測器，KQ-250DE數控超聲波清洗器、WP-UP-IV-20沃特浦超純水機、紫外可見光分光光度計UV2550。

主要試劑有無水乙醇、乙醇和甲醇，槲皮素對照品（批號為100081-20108）、木犀草素對照品（批號為111520-200504）、維生素C對照品（100425-201103），均購于中國藥品生物制品檢定研究院，DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苦肼）購于美國sigma公司。

2.2 測定方法

2.2.1 以水和乙醇為溶劑的提取方法

取表1中4個地點的樣品混合后隨機抽取200 g的烏飯鮮果陰干、粉碎，過3號篩。分別精確稱取粉末約0.2 g各置于3個三角瓶中，再分別加入水、95%乙醇、60%乙醇各25 mL，超聲處理（功率250 W，頻率30 KHZ）30 min，濾過后得到供試樣品液。然后取各供試樣品溶液加入試管中，加入1×10-4mol/L的LDPPH.溶液2 mL，密閉放置30 min，以無水乙醇溶液為空白，在517 nm處測定其吸光度（A2）；又取各供試品溶液加入試管中，加入無水乙醇溶液2 mL，也以無水乙醇溶液為空白，在517 nm處測定其吸光度（A0）；再取無水乙醇溶液加入試管中，加入1×10-4mol/L DPPH.溶液2 mL，以無水乙醇溶液為空白，在517 nm處測定其吸光度（A1）。計算其對 DPPH的抑制率，其計算式如下：

2.2.2 不同濃度提取液清除DPPH.自由基活性的測定方法

從采自贛州峰山編號為GF的樣品中隨機抽取200 g的烏飯鮮果陰干、粉碎，過3號篩，取粉末約0.2 g置于三角瓶中，分別加入水和60%乙醇，每次 25 mL，超聲處理2次，每次處理30 min，濾過后合并濾液，即得水提取液和60%乙醇提取液。配置DPPH溶液，即稱取1.18 mg的DPPH置于三角瓶中，加入無水乙醇溶液30 mL使其溶解，制成1×10-4mol/L的溶液，然后進行不同濃度提取液清除DPPH自由基活性的測定。不同產地的樣品其測定方法均與此相同。

2.2.3 槲皮素含量的測定

烏飯果實中的抗氧化物質主要是槲皮素[18-19]，其測定方法如下：取不同地點的鮮果樣品陰干，粉碎后過3號篩以備用；取其粉0.5 g，加入甲醇∶鹽酸為10∶1的混合溶液25 mL，靜置30 min；放于60 ℃的水浴中超聲（200 W，40 kHz）1 h，濾液過0.45 μm的微孔濾膜，即得供試樣品溶液。色譜柱為Agilent Zorbax-SB C18（4.6×250 mm，5 μm），流動相為甲醇∶0.2%磷酸溶液（55∶45），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長360 nm，進樣量10 μL，柱溫25 ℃。又取槲皮素對照品4.805 mg，置入10 mL的量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度即得對照品溶液。取不同地點的樣品制備溶液，進樣10 μL，分別測定峰面積，計算槲皮素含量。

3 結果與分析

3.1 不同溶劑的提取效果

分別以水和不同濃度的乙醇為溶劑提取烏飯樹果實（樣品編號為GF，重復3次，即n＝3），其水、60%乙醇、95%乙醇提取液對DPPH自由基的抑制率分別為94.10%、98.31%和97.57%；乙醇提取液的清除率（抑制率）略高于水提取液的清除率，但兩者都超過了90%，兩者間沒有顯著性差異（見表2）。考慮到烏飯樹果實的最大實用價值是用作保健食品，因此，以水為溶劑提取其抗氧化物質并進行開發利用，具有可靠的安全性和優勢。

表2 烏飯樹果實不同溶劑的提取液對DPPH自由基的清除率Table 2 Clearance rate of DPPH.free radical of extracts in different solvents from Vaccinium bracteatum fruits

3.2 不同濃度提取液抑制DPPH自由基的活性

DPPH自由基是一種以氮為中心的很穩定的自由基，常用于測定抗氧化物質的抗氧化活性，若受試物能夠清除它，則表示受試物具有降低羥基自由基、烷基自由基或者過氧自由基的能力或打斷脂質過氧化鏈反應的作用即抗脂質氧化的作用[13-14]。其對DPPH的清除率越大，說明其抗氧化性越強。本文選用贛州峰山樣品（GF）進行測定（n＝3），得到的不同濃度提取液抑制DPPH自由基的效果如表3。由表3可知，60%乙醇提取液的抗氧化性最強，而水提取液的安全性較好，因此采用水和60%乙醇提取液比較分析了不同濃度提取液抑制DPPH自由基活性的效果。

表3 烏飯果實水和60%乙醇的提取液及Vc對DPPH的清除率Table 3 Comparison of clearance rate of DPPH between aqueous and 60% ethanol extracts of Vaccinium bracteatum fruits,and the rate of Vc to scavenge DPPH free radical

設自由基清除率為50%時所需樣品的質量濃度為IC50，IC50值越小，說明其抗氧化活性越強。表3表明，水提取液的IC50值小于60%乙醇提取液的IC50值，說明水提取液的抗氧化活性更強。其次，這兩種提取液都表現為隨著濃度的增加其對自由基的清除效果也相應增強，而且清除效果都達到94%以上，說明烏飯樹果實具有較好的抗氧化效果。另外，水提取液對自由基的清除率達到94.68%時其所需濃度為2.06 mg·mL-1，而60%乙醇提取液對自由基的清除率達到97.44%時其所需濃度僅為1.35 mg·mL-1。這一結果表明，水提取液通過加大濃度可以獲得較高的自由基清除效果，也反映了果實中可能還存在一些不溶于水而溶于60%乙醇的抗氧化成分，對此尚需進一步研究。

3.3 水提取液抗氧化活性的地理差異

不同產地的烏飯樹果實樣品水提取液對DPPH自由基的清除率見表4。由表4可知，IC50值最小的來自贛州峰山的樣品（GF）；其他3個地區樣品的IC50值相近，其平均值為0.717 mg·mL-1，這與樣品 GF的 IC50值 (0.32 mg·mL-1)相差 1.2倍，IC50值越小說明其抗氧化活性越強。另外，表4中清除率較高的樣品分別來自贛州峰山和萍鄉。不同產地的樣品其清除率從高至低依次是樣品GF＞樣品PX＞樣品YX＞樣品LY，基本上呈現出由低緯度向高緯度逐漸變小的趨勢，這與烏飯樹優株果實大小的地理變化規律一致[20]。基于此規律并結合IC50值的變化情況分析認為，緯度較低的贛南地區不僅是選擇優良抗氧化效果的烏飯樹優株的重要地區，也是選擇大果型優株的重要地區。

表4 不同產地的烏飯樹果實樣品水提取液對DPPH自由基的清除率Table 4 Clearance rate of DPPH free radical of aqueous extract from samples of Vaccinium bracteatum fruit

3.4 水提取液中主要抗氧化物質槲皮素含量的地理差異

槲皮素是烏飯樹果實中主要的抗氧化物質，而且研究結果顯示，其木犀草素含量極少，因此，本文沒有測定木犀草素含量。烏飯樹果實槲皮素含量的地理差異情況如圖1所示。圖1表明，贛州峰山樣品（GF）中的槲皮素含量最高（30.0 mg·g-1），是宜興樣品(YX，4.5 mg·g-1）的6.7倍，是萍鄉樣品（PX，7.2 mg·g-1）的4.2倍，是瀏陽樣品（LY，8.5 mg·g-1）的3.5倍。由于萍鄉和瀏陽兩地果實的槲皮素含量相近，因此認為，烏飯樹果實中的槲皮素含量基本呈現出從低緯度到高緯度逐漸減少的變化規律，這與其水提取液抗氧化效果的地理變化規律和優株果實大小的地理變化規律均相一致。

圖1 烏飯樹果實中槲皮素含量的地理差異Fig.1 Differences of Qercetin contents of Vaccinium bracteatum fruit in different geographic areas

3.5 抗氧化活性的比較

3.5.1 與VC抗氧化活性的比較

不同產地的烏飯果實都含有VC，而獨立考察VC對DPPH自由基的清除效果，對于評估烏飯果實的抗氧化作用具有一定意義。稱取VC10.0 mg，配成質量濃度為0.4 mg·mL-1的VC水溶液，又取此液分別加入以乙醇配成的質量濃度分別為10、20、40、60、100 和 500 μg·mL-1的 VC測定溶液；再分別取各濃度的VC測定液1 mL，都加入3 mL的DPPH溶液，30 min后于517 nm處測定其吸光度（A）并計算（n＝3），結果見表5。由表5可知，VC清除DPPH自由基的IC50值所需濃度為3.29 μg·mL-1，而烏飯樹果實水提取液的 IC50值所需濃度為 0.32 mg·mL-1（320 μg·mL-1），即要清除50%的DPPH自由基，烏飯樹果實水提液的用量大約是VC的97倍。這是因為，水提取液是粗提取液，因此要達到清除50%自由基的效果必然要增加用量；但烏飯樹葉精提物的抗氧化效果卻是VC的 1.4 倍[9]。

3.5.2 與其它果品的比較

烏飯樹果實和藍莓、蘋果等果品都含有豐富的多酚類抗氧化物質。多酚類化合物是指分子結構中有若干個酚性羥基成分的總稱，它包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷等成分，槲皮素是黃酮類化合物的一種。本文將烏飯樹葉乙醇提取物[7,23]、烏飯果實水提取物、藍莓（果）乙醇提取物[24-25]和‘國光’蘋果乙醇提取物[22]對DPPH自由基的清除效果及其抗氧化物質含量進行了比較，結果見表5。由表5可知，幾種果品抗氧化物質含量的大小順序是烏飯葉＞烏飯果＞蘋果＞藍莓；其抗氧化能力的強弱順序也是烏飯葉＞烏飯果＞蘋果＞藍莓，這可能是我國古老的傳統食品“烏飯”之所以代代相傳的主要原因。但是，不同的植物果實所含的主要抗氧化成分不同，因此對不同的氧化物質的清除效果也不同，如蘋果中的VC含量較高，其抗脂質氧化的效果強于烏飯樹葉[21-22]，因此，富含VC的蘋果、獼猴桃等在抗脂質氧化方面均有優勢；其次，同一種植物不同器官的抗氧化效果不同，如烏飯葉雖然抗氧化物質含量較高，但各種色素比果實少，這正是果實具有較好的保護視網膜等功能的反映。

表5 不同果實或葉片對DPPH自由基的清除效果及其抗氧化物質含量的比較Table 5 Clearance effect of DPPH and the contents of antioxidant components of fruits or leaf

4 討 論

4.1 提取溶劑與食品安全的關系

雖然以60%乙醇為溶劑提取烏飯果實所得的提取液對DPPH的清除率高于水提取液（表2），而水提取液的食用安全性好，這對于烏飯果實主要作為食品開發利用非常重要。但是，60%乙醇提取液可以提取到一些不溶于水的抗氧化成分，從而表現出只要較低濃度的提取液就能達到97.44%的清除率（表3）。因此，乙醇提取方法可以應用于精提某些特殊抗氧化成分，這對藥品或具特殊功能的保健食品的開發具有重要價值。

4.2 烏飯樹果實與葉的抗氧化效果問題

本文分析認為，烏飯樹葉與果實的抗氧化物質含量從大到小依次是烏飯葉＞烏飯果，其抗氧化能力也是烏飯葉＞烏飯果；其次，烏飯葉比果的資源培育更簡便，因此有利于形成以烏飯葉為基礎的產業技術開發，促進區域經濟發展。但是，烏飯果含有豐富的不同類型的天然色素和花色苷，這在保護視網膜和清除肝細胞自由基等方面具有特殊的意義[17]，故其作為小漿果類型鄉土果樹品種的選育與利用具有很大的市場前景。

4.3 品種選育與地理區域的關系

烏飯樹果實抗氧化物質（槲皮素）含量、水提取液抗氧化效果以及優株果實大小都呈現出從低緯度到高緯度逐漸減少（小）的地理變化規律，這表明優良品種的選育應遵循這個規律，其中較低緯度的南嶺地區（包括贛州南部）具有較高的概率發生優良植株，其原因可能是南嶺地區是烏飯樹自然分布區的近邊緣，并且此區域地形變化多樣，從而導致其生境多樣化，因此有利于物種發生遺傳分化和變異。

5 結 論

（1）烏飯果的水提取液對DPPH自由基的清除效果達到了94.10%，并具有較好的食用安全性。而其60%乙醇提取液中含有一些不容水的抗氧化成分，只需較低的濃度就能達到97.44%的清除率，因此，乙醇提取方法適用于精提工藝。

（2）烏飯樹葉的抗氧化物質含量（槲皮素）和抗氧化能力（清除DPPH自由基）都高于烏飯果；但烏飯果含有豐富的不同類型的天然色素和花色苷，故其某些功能效果要優于葉。

（3）水提取液是粗提取液，雖然含有不同類型的抗氧化化合物，而清除DPPH自由基的能力低于精提物；另外，清除50% DPPH自由基的烏飯果實水提液的用量約為VC的97倍。

（4）烏飯樹果實抗氧化物質（槲皮素）含量和水提取液抗氧化效果都呈現出地理變化規律，較低緯度的南嶺地區（包括贛州南部）可發現烏飯樹優良植株，因此，應該特別關注該地區對于選育優良品種的重要性。

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