不同處理對滇重樓種子萌發(fā)的影響

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

滇重樓Paris polyphyllavar.yunnanensis（Franch） Hand-Mazz，屬百合科Liliaceae重樓屬Paris多年生直立草本植物[1-2]，又名七葉一枝花、燈臺(tái)七、王孫、蚤休等[3]。味苦，性微寒，有微毒，以干燥地下莖入藥，活性成分為甾體皂苷[4]，其中，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量被《中國藥典》（2010年版）規(guī)定為評價(jià)重樓品質(zhì)的重要指標(biāo)[5]，具有抗腫瘤[6-7]、抑菌抗病毒[8-9]、防治心血管疾病[10]、毒蛇咬傷、腎臟保護(hù)[11]、跌撲傷痛、驚風(fēng)抽搐等多種藥理作用，是云南白藥、宮血寧、奪命丹等中成藥的重要原料[12-13]。莖葉1 a倒苗，全體光滑無毛，株高30～100 cm。且具有越冬期長、營養(yǎng)生長期較短、生殖生長期較長的特點(diǎn)。一般當(dāng)年11月中下旬倒苗后即進(jìn)入越冬期，翌年3月萌動(dòng)，5月從臺(tái)葉盤上抽薹開花。從5月開花至10月種子成熟，生殖生長期長達(dá)5個(gè)多月，其營養(yǎng)生長貫穿于生長發(fā)育的全過程[14-15]。

近幾年，隨著對滇重樓藥理作用的深入研究，其價(jià)值也不斷被開發(fā)，造成需求量不斷攀升，而野生貯藏資源極度缺乏，造成藥材原料緊缺。2012年，楊斌等[16]研究表明我國野生滇重樓資源被開發(fā)利用的已達(dá)到80%，現(xiàn)已被列為云南省30種稀缺瀕危天然藥物之一。因此，人工種植對緩解滇重樓野生資源就變得尤為重要。又因其宜陰畏曬，喜濕忌燥，懼霜凍和陽光直射，對環(huán)境條件適應(yīng)性較強(qiáng)，荒坡、溝邊、林下都可以種植[14]。且近年來，隨著我國林權(quán)制度的改革，林下種植這種林業(yè)復(fù)合生產(chǎn)模式在遵守生態(tài)優(yōu)先、因地制宜、可持續(xù)發(fā)展的原則下也迅速發(fā)展起來。而重樓屬植物的種子繁殖系數(shù)較大，通過種子的有性繁殖結(jié)合林下種植方式是獲得大量種苗的有效方法，但由于其種子具有“二次休眠”的特性，萌發(fā)速度慢，需要經(jīng)過二次低溫處理才能萌發(fā)。在自然情況下，滇重樓種子第一年的萌發(fā)率較低，大多數(shù)種子在來年才進(jìn)行二次萌發(fā)，導(dǎo)致其存在出苗不一致，生長不整齊等問題，影響種子的繁殖效率，造成其在自然條件下年生產(chǎn)量不能滿足產(chǎn)業(yè)的年消耗量，因此滇重樓種子繁殖技術(shù)當(dāng)前的關(guān)鍵問題是要打破種子休眠，提高種子當(dāng)年的萌發(fā)率。本研究利用不同外源激素和試劑處理滇重樓種子，觀察其萌發(fā)情況，以找到提高滇重樓種子的萌發(fā)速度和萌發(fā)率的方法，為滇重樓的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模種植育苗與資源再生提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

供試材料滇重樓種子購于云南大理，于中南林業(yè)科技大學(xué)植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室脫去外種皮，置于4 ℃冰箱保存，播種基質(zhì)為河沙；試驗(yàn)儀器采用KQ-600E型超聲波清洗器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子千粒質(zhì)量

隨機(jī)選取1 000粒去掉外種皮的滇重樓種子，用萬分之一的分析天平準(zhǔn)確稱量，3次重復(fù)。同時(shí)隨機(jī)選取100粒種子，利用精確度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺測量種子的長度和寬度，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.2 浸種處理

挑選成熟、大小一致、無病害與機(jī)械損傷的種子為試驗(yàn)材料，設(shè)置不同的激素處理濃度，將種子浸泡在不同的處理溶液中（見表1），均置于24 ℃恒溫條件下浸種48 h，然后將種子用紗布打包，放入超聲波清洗器40 min、50 ℃、200 W超聲波處理[17]。超聲波處理結(jié)束后，將種子用純凈水反復(fù)沖洗干凈，取同一處理種子100粒均勻沙藏于托盤中，以純凈水處理相同時(shí)間作為對照（CK），每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將經(jīng)過浸種處理的種子與濕沙按1∶2的體積比混合，并施以種子質(zhì)量5%的多菌靈可濕性粉劑拌勻殺菌，然后進(jìn)行二次變溫處理2 ℃→20 ℃→4 ℃。

表1 4種試劑的不同處理水平Table 1 Different treatment with four kinds of soaking reagents

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)采用萌發(fā)率來評價(jià)不同試劑處理水平對滇種子萌發(fā)的影響。滇重樓種子胚根突破種皮視為萌發(fā)，分別于處理后30、40、50、60、90 d觀察記錄種子的萌發(fā)情況測定并記錄其最長胚根長度（取每個(gè)重復(fù)的最長胚根長度再求均值），參考宋發(fā)軍等[18]的試驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)胚根長＞3 cm的種子所占比例。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007處理，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，差異性顯著分析采用Duncans檢驗(yàn)方法，并設(shè)置P＜0.05為差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的千粒質(zhì)量

滇重樓種子多數(shù)為卵球形，去除鮮紅色的外種皮后，其千粒質(zhì)量為84.014 6 g，種子平均長度為4.33 mm，種子平均寬度為4.04 mm。

2.2 GA3對滇重樓種子萌發(fā)率的影響

50～600 mg/L的GA3浸種處理對滇重樓種子的萌發(fā)均存在不同程度的促進(jìn)作用，見表2。由表2可知，在30～90 d內(nèi)，隨著濃度的增加，萌發(fā)率呈先升高后下降的趨勢，500 mg/L GA3對滇重樓種子的萌發(fā)具有顯著的促進(jìn)作用，90 d時(shí)，其萌發(fā)率比CK（40.33%）增加了42%，400 mg/L的處理次之，比CK增加了 38.34%。當(dāng)GA3濃度≥500 mg/L時(shí)，萌發(fā)率開始下降，但仍然高于CK。結(jié)果表明，用GA3對滇重樓的種子進(jìn)行浸種處理，有利于打破滇重樓種子的二次休眠，大大提高其萌發(fā)率與出苗的一致性。

2.3 2,4-D對滇重樓種子萌發(fā)率的影響

由表3可知，與CK相比，采用不同濃度的2,4-D溶液浸種預(yù)處理滇重樓的種子，30～90 d內(nèi)，0.2 mg/L與0.4 mg/L的2,4-D浸種能提高滇重樓種子的萌發(fā)率，90 d時(shí)，分別比CK提高了1.67%與13%。當(dāng)2,4-D濃度≥0.6 mg/L時(shí)，萌發(fā)率開始下降，說明高于0.4 mg/L的2,4-D會(huì)抑制滇重樓種子的萌發(fā)。30～90 d內(nèi)，1.0 mg/L的2,4-D溶液浸種處理滇重樓種子，其萌發(fā)率一直低于CK，在一定程度上促進(jìn)了種子的再次休眠。

表2 不同GA3濃度對滇重樓種子萌發(fā)率的影響?Table 2 Effect of GA3 concentration on seed germination of P.polyphylla var.yunnanensis %

表3 不同2,4-D濃度對滇重樓種子萌發(fā)率的影響Table 3 Effect of 2,4-D concentration on seed germination of P.polyphylla var.yunnanensis %

2.4 NAA對滇重樓種子萌發(fā)率的影響

由表4可知，采用不同濃度NAA溶液浸種后，90 d時(shí)，僅有20 mg/L NAA浸種處理組滇重樓種子萌發(fā)率比CK高10.34%，其余濃度NAA浸種處理滇重樓種子萌發(fā)率均低于CK。當(dāng)NAA濃度≥40 mg/L時(shí)，則不同程度地抑制了種子的萌發(fā)，且隨著濃度的增加，抑制作用也增強(qiáng)。尤其是濃度為100 mg/L時(shí)，萌發(fā)率受到嚴(yán)重抑制，萌發(fā)率比CK降低了29.66%。由萌發(fā)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知，除20 mg/L NAA溶液浸種對滇重樓種子萌發(fā)率具顯著的影響，其他濃度均不具顯著影響。可見，用高濃度NAA溶液浸種處理滇重樓種子，不利于打破種子的休眠。

表4 不同NAA濃度對滇重樓種子萌發(fā)率的影響Table 4 Effect of NAA concentration on seed germination of P.polyphylla var. yunnanensis %

2.5 稀H2SO4處理對滇重樓種子萌發(fā)率的影響

從表5可知，利用稀H2SO4浸種處理滇重樓種子，90 d時(shí)，稀H2SO4浸種濃度為10%時(shí)，滇重樓種子萌發(fā)率比CK增加了14.34%，而30%的稀H2SO4浸種對其種子萌發(fā)則具有一定的抑制作用，與CK相比，降低了16.66%。由此可知，低濃度（10%）的稀H2SO4浸種處理滇重樓種子可以提高種子的萌發(fā)率，高濃度反而抑制其萌發(fā)。

2.6 組間優(yōu)異效果比較

試驗(yàn)結(jié)果表明：500 mg/L GA3、0.4 mg/L 2,4-D、20 mg/L NAA、10%的稀H2SO4是4種有效促進(jìn)種子萌發(fā)的預(yù)處理方法。90 d時(shí)，當(dāng)GA3濃度為500 mg/L時(shí)，滇重樓種子萌發(fā)率達(dá)到了82.33%；當(dāng)2,4-D濃度為0.4 mg/L時(shí)，萌發(fā)率為53.33%；當(dāng)NAA濃度為20 mg/L時(shí)，萌發(fā)率為50.67%；當(dāng)稀H2SO4濃度為10%時(shí)，萌發(fā)率為54.67%。而30～90 d內(nèi)，500 mg/L GA3浸種處理滇重樓種子萌發(fā)率一直高于CK，由此可見，4種有效提高滇重樓種子萌發(fā)率的預(yù)處理方法中500 mg/L GA3對滇重樓種子的萌發(fā)速度和萌發(fā)率的促進(jìn)作用最顯著（見表6）。

表5 不同稀H2SO4濃度對滇重樓種子萌發(fā)率的影響Table 5 Effect of dilute H2SO4 concentrations on seed germination of P.polyphylla var.yunnanensis %

表6 4種試劑最佳濃度浸種對滇重樓種子萌發(fā)率的影響比較Table 6 Comparison of four kinds of reagents optimal concentrations of pretreatment on P.polyphylla var. yunnanensis germination of seeds %

此外，從表7可知，在4種有效浸種方式的處理下，500 mg/L GA3對胚根生長具有顯著影響，90 d時(shí)，其胚根最長長度達(dá)到了5.08 cm，比CK（4.15 cm）長0.93 cm，其他幾種處理與CK相比并無顯著差異（見圖1-A）。與此同時(shí)，4種試劑最佳濃度浸種胚根長＞3 cm的種子比例分別為68.33%、47.33%、44.33%和36.67%，均高于CK（34.33%），分別高34%、13%、10%和2.34%（見圖2），圖1- B、C、D、E直觀的展示出在第40、50、60、90天時(shí)滇重樓種子萌發(fā)胚根的生長狀況。綜上所述，與CK相比，4種試劑浸種均在不同程度上促進(jìn)滇重樓種子萌發(fā)過程中胚根的生長，其中以500 mg/L GA3作用最為顯著，且在第126天時(shí)，500 mg/L GA3浸種處理的種子最早出苗（見圖1-F）。

表7 4 種試劑最佳濃度浸種對滇重樓種子萌發(fā)最長胚根長度的影響比較Table 7 Comparison of four kinds reagent concentrations on the longest radicle growth of P.polyphylla var.yunnanensis cm

圖1 4種有效處理方式對滇重樓種子胚根生長的影響Fig.1 Effects of four kinds of effective treatments on radicle growth of P.polyphylla var.yunnanensis seeds

圖2 4種有效的處理方式下第90天胚根超過3 cm的種子所占比例Fig.2 The percentage of radicle length more than 3 cm of 90-day-grown seeds under four effective treatments

3 結(jié)論與討論

本研究表明，不同試劑浸種處理對打破滇重樓種子萌發(fā)具有一定的差異，通過試驗(yàn)結(jié)果可以看出：在30～90 d內(nèi)，綜合GA3、2,4-D、NAA、稀H2SO44種外源試劑在一定濃度范圍內(nèi)均能促進(jìn)滇重樓種子萌發(fā)及其胚根生長，其中以500 mg/L的GA3浸種處理的效果最佳，處理90 d后，其萌發(fā)率（82.36%）比CK（40.45%）增加了104%，胚根長度（5.08 cm）比CK（4.15 cm）增加了22%。低濃度的NAA、稀H2SO4雖也能促進(jìn)種子萌發(fā)，但本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)的NAA最低濃度為20 mg/L、稀H2SO4最低濃度為10%，在此濃度以下是否還存在著更佳的濃度與關(guān)于不同外源試劑如何影響滇重樓種子萌發(fā)的機(jī)理則還有待進(jìn)一步研究。

種子休眠是植物具有正常活力的種子萌發(fā)的一種適應(yīng)機(jī)制，此時(shí)的種子處于適宜的萌發(fā)條件而不能正常萌發(fā)[19]。但種子休眠期過長會(huì)影響植物本身的生產(chǎn)種植，從而降低經(jīng)濟(jì)效益，而運(yùn)用植物外源激素浸種可以破壞妨礙種子萌發(fā)的活性物質(zhì)，打破種子休眠，從而有利于種子的吸水萌發(fā)[20]。因此，眾多學(xué)者圍繞著如何打破種子休眠，提高其萌發(fā)率做了大量的研究。GA3是打破種子休眠過程中的關(guān)鍵內(nèi)源信號分子[21]。孔欣然等[22]研究表明：用500 μmol/L 的 GA3對薄皮木種子進(jìn)行預(yù)處理，其發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到最高值；梁文華等[23]用500 mg/L GA3浸種狹葉薰衣草種子24 h，也得出與其一致的結(jié)論。李永紅等[24]發(fā)現(xiàn)NAA濃度為10 mg/L處理大果薔薇種子時(shí)發(fā)芽率最高，可達(dá)53.6%，低于或高于此濃度均會(huì)抑制其種子萌發(fā)。2,4-D能影響細(xì)胞的分裂、伸長、分化。NAA可促進(jìn)細(xì)胞分裂，擴(kuò)大、誘導(dǎo)形成不定根，促進(jìn)新陳代謝和光合作用，加速生長發(fā)育，增加坐果[25]。還有研究表明，內(nèi)源激素含量不僅影響種子萌發(fā)，在茄子雄性不育和單性結(jié)實(shí)的發(fā)生中也起著重要作用[26]。而本文中滇重樓種子萌發(fā)與內(nèi)源激素含量的關(guān)系如何則需要進(jìn)一步研究。稀H2SO4由于其中的硫酸分子已經(jīng)被完全電離，雖然不具有濃H2SO4的脫水性（俗稱炭化，即強(qiáng)腐蝕性），但適當(dāng)濃度的稀H2SO4浸種預(yù)處理種子可軟化其種皮。而滇重樓的種子萌發(fā)在生產(chǎn)育苗中，若不能找到有效的方法打破其種子的“二次休眠”，則會(huì)在自然情況下出現(xiàn)出苗周期長、萌發(fā)率低等情況。為此，王艷芳等[27]研究發(fā)現(xiàn)在最低溫度高于10 ℃的冬季用600 mg/L的GA3撒播可使滇重樓種子的出苗時(shí)間縮短至5個(gè)月左右，且出苗率可達(dá)50%以上；李寶等[28]研究表明在20 ℃恒溫下培養(yǎng)滇重樓種子，其萌發(fā)率100 d后可達(dá)98.89%；徐文娟[29]研究表明GA、FL、ACC與6-KT均能在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)滇重樓種子的萌發(fā)。且用不同外源激素處理種子萌發(fā)時(shí)，不同處理濃度、時(shí)間與溫度通常會(huì)對處理效果產(chǎn)生影響，薛婷婷等[30]以核桃種子為材料研究發(fā)現(xiàn)種仁的生理代謝對溫度的響應(yīng)會(huì)影響種子的萌發(fā)率。而本研究僅在單因素下分析了滇重樓種子的萌發(fā)與胚根生長情況，存在一定的局限性，因此可運(yùn)用此研究的最優(yōu)處理結(jié)合不同處理溫度、時(shí)間、與貯藏方式等多因素做進(jìn)一步研究，并探究在不同處理下最優(yōu)處理的種子萌發(fā)生理與內(nèi)源激素等變化，為滇重樓種子的萌發(fā)提供理論依據(jù)。

從長遠(yuǎn)來看，許多藥用植物產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中種子繁殖是最為經(jīng)濟(jì)有效的方法，但種子休眠亦是藥用植物存在的一種常見現(xiàn)象，因而只有不斷地探索出有利于打破種子休眠的試劑與合適濃度，才能更好地解決目前中藥材供求矛盾，同時(shí)也是保護(hù)野生資源的最佳途徑。

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