28種杜鵑親緣關系ISSR分析

廖菊陽 ，吳林世 ，劉 艷 ，胥 雯 ，李高飛

（1.湖南省森林植物園，湖南 長沙 410116；2.國家林業和草原局 杜鵑工程技術研究中心，湖南 長沙 410116）

杜鵑花是中國傳統的十大名花之一，屬于杜鵑花科Ericaceae杜鵑屬Rhodohendron。杜鵑屬是杜鵑花科中最大的屬，種類繁多，分布廣泛[1]。在我國，杜鵑花種植歷史悠久，從有記錄的栽培到現在已有一千多年，因其花冠顏色艷麗，具有較高的觀賞價值，我國國內多地均有種植，我國江西、安徽、貴州等省更是以杜鵑花作為省花[2-3]。世界范圍內，杜鵑野生品種超過980種，中國有600多種[4]。通過原生種不斷雜交培育，目前已經繁育出近10 000個園藝品種[5]，這些杜鵑主要分為5大品系：春鵑品系、夏鵑品系、西鵑品系、東鵑品系、高山杜鵑品系[6-7]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat）簡單重復序列擴增，是一種微衛星類的分子標記技術，用錨定的微衛星DNA作為引物，隨機擴增基因組片段。因其相比SSR與RAPD技術而言，ISSR具有操作簡便、無需預知基因序列、準確度高、重復性好的優點，目前廣泛應用于親緣關系鑒定、物種進化分析等方面[8-10]。

我國杜鵑花野生資源豐富，這對于研究杜鵑的種質資源有著天然的優勢，但我國在整體的植物資源研究方面起步較晚，目前相較于國外，我國的杜鵑花育種、分子水平上的研究仍然落后。此外由于杜鵑花品種繁多，導致分類體系復雜化，難以從名稱、表型判斷不同品種間的親緣關系。關于杜鵑花的遺傳多樣性研究雖已有一些報道，但多數集中在園藝品種方面，對于原生品種的研究較少。近年來隨著分子生物技術快速發展，各種分子標記技術運用越來越廣泛，技術水平也越來越完善，為更簡便地評價植物種質資源提供了可能。近年來，有學者利用ISSR和RAPD分子標記技術分析了在長白山野生的杜鵑的遺傳多樣性[11-12]、利用ISSR技術揭示了自然分布種群杜鵑的遺傳多樣性[13]、通過ISSR技術對杜鵑屬植物進行了遺傳體系的研究估計[14]等。本實驗在前人的研究基礎上選取湖南省森林植物園內28種生長狀態良好，表現性狀突出且種群數量多、便于觀察物候及變異性，同時具有較高觀賞價值的杜鵑，利用ISSR分子標記對其進行遺傳多樣性分析，以探究不同種之間的親緣關系，為杜鵑屬植物準確分類提供參考及雜交選育新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗供試材料于2017年3月取自湖南省森林植物園杜鵑種質資源庫，包含28個杜鵑種（見表1），選擇幼嫩葉片，取樣后立即保存至-70 ℃冰箱備用。

表1 供試的28個杜鵑種Table 1 List of 28 barieties of Rhododendron

1.2 DNA提取

用液氮將葉片樣本磨成粉末后分裝入1.5 mL離心管中，使用北京天根生化有限公司生產的植物基因組DNA提取試劑盒對所取28份杜鵑樣本進行DNA提取。得到DNA后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，用分光光度計檢測其濃度并稀釋到 100 ng/ μL，-20 ℃保存備用。

1.3 ISSR-PCR擴增

PCR擴增的引物采用哥倫比亞大學公布的100條ISSR引物，選擇UBC801-UBC850進行實驗，引物由布蘭哲生物有限公司合成。經過優化確定PCR 反應體系為：1 μL DNA，1 μL 引物，0.5 μL Taq 酶，10 μL Master Mix，7.5 μL 雙蒸水，其中Taq酶與Master Mix購自Takara生物有限公司。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 40 s，72 ℃終延伸2 min，4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖電泳檢測。

1.4 數據分析

人工比對電泳圖譜，將同一位置出現清晰條帶的記為“1”，無條帶或條帶不清晰記為“0”，用Excel生成“0”“1”矩陣，利用軟件NTSYS進行ISSR數據分析，計算Nei’s遺傳相似系數，并進行UPGMA聚類分析，構建聚類分析圖譜。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

從電泳圖譜中可以看出各DNA條帶清晰、明亮，無彌散帶，略有降解，表明提取純度較好，無RNA、蛋白質雜質（見圖1）。用分光光度計在A260/A280下測其濃度，吸光度均在1.8～2.0之間，濃度在344～382 ng/μL，表明DNA濃度符合實驗要求。

圖1 28種杜鵑DNA提取結果Fig.1 DNA extraction results of 28 species Rhododendron

2.2 引物篩選

選擇表型差異較大的3個杜鵑品種用50條引物進行擴增，篩選出在3個品種中均能擴增出條帶且多樣性較豐富的引物作為擴增引物。結果獲得12條擴增效果較好的引物（表2）。12條引物共擴增出132條清晰條帶，其中有127個位點具有多樣性，多樣性比例為96.21%，說明28個杜鵑品種遺傳多樣性較豐富。每條引物最少可以擴增9個DNA片段，引物UBC840擴增片段最多，為15條。平均每條引物可以擴增11個片段和10.58個多態性片段。

2.3 杜鵑品種的遺傳多樣性分析

通過對28個杜鵑品種的遺傳參數進行計算分析，結果顯示：28個杜鵑品種平均觀察等位基因數為2.0，平均有效等位基因數為1.435 8，平均Nei’s基因多樣性指數為0.277 8，平均Shannona信息指數為0.434 0。在各個位點上，有效等位基因最小值為1.036 7，最大值為1.879 2；Nei’s基因多樣性指數最大值為0.467 9，最小值為0.070 1；Shannon信息指數最大值為0.660 6，最小值為0.090 2，表明28個杜鵑種間存在豐富的遺傳多樣性。

2.4 聚類分析

以28個杜鵑種的132條擴增條帶為原始矩陣，計算出的 Nei & Li 遺傳距離和遺傳相似系數，其中相似系數最大的為0.928 5（西施杜鵑與鹿角杜鵑），最小為0.285 7（毛棉杜鵑與西洋杜鵑），經過UGPMA聚類分析，獲得親緣關系樹狀圖（圖2）。以平均相似系數0.588為閾值，可將28份材料分為3個大類群：第I類群包括鹿角杜鵑等馬銀花亞屬的3個長蕊組樣品、2個常綠杜鵑亞屬種以及興安杜鵑和羊躑躅共7個種。第II類群包括毛果杜鵑等13個映山紅亞屬種和4個杜鵑亞屬種，共16個種。第III類群包括馬銀花等4個馬銀花亞屬種，分為馬銀花組和長蕊組。從上述28個杜鵑的遺傳聚類結果分析發現：遺傳聚類結果與傳統形態學分類基本一致，遺傳距離越近的品種，其生理生態表現往往越接近，在遺傳圖譜中聚到一類，但在大類劃分上，往往缺乏嚴苛明確的標準，不少種類在劃分時甚至相互交叉，對研究造成不利。

表2 用于杜鵑品種遺傳多樣性分析的ISSR引物及其擴增結果Table 2 ISSR primers used in analysis of genetic dicersity of Rhododendron

圖2 引物UBC840在28個杜鵑品種中的擴增結果Fig.2 ISSR profiles of 28 varieties in Rhododendron amplified by primer UBC840

從圖3可以看出，鹿角杜鵑、長蕊杜鵑、短脈杜鵑、羊躑躅等的遺傳相似系數較高，但他們的植物形態差異較大，可能與他們的生長環境、種群之間基因交流頻繁程度有關，鹿角杜鵑與西施杜鵑、短脈杜鵑與猴頭杜鵑之間相近的親緣關系與頻繁的種群基因交流造成他們之間遺傳分化不明顯，而羊躑躅可能因為與上述種群生長環境差異較大，基因交流較少而分化出較為明顯的差異性狀。

第II類群中，西洋杜鵑為夏鵑，與其他春鵑區分開來，單獨聚成一支，說明夏鵑品種特異性較強，與其他品種區別明顯。而與遺傳距離較為接近的錦繡杜鵑、金萼杜鵑等相比較，他們葉型相近，但花色、花型差異較大。這可能是由于在栽培過程中，種群之間基因交流或生長環境改變造成植株相應的變化，這些變化首先從生殖器官體現出來，而葉片敏感性較低，故多數保留了原始的性狀，因此有將植物葉型作為分類指標的說法[15]。

此外，從總體上來看，品種來源地與品種間親緣關系不具有直接相關性。例如西施杜鵑與錦繡杜鵑同來自湖南長沙，分類上卻屬于兩個不同大類。而馬銀花與紅馬銀花，雖來源地不同，但遺傳距離非常接近，大多數表型也類似，可見具有相同名字的品種往往在分類上更加接近，他們可能具有共同的祖先，在分化過程中自然突變形成了如今的差異形態。

3 結論與討論

本研究對28份杜鵑屬植物進行ISSR擴增，擴增得到132條條帶，多態性條帶127條，多態性比率高達96.21%，表明杜鵑在遺傳進化過程中發生了豐富的變異，同時也說明ISSR能夠很好地將他們區分開來。而從聚類分析圖中可以看出，28種供試杜鵑之間既有不同數值的遺傳距離又能聚類在一起，說明它們之間具有相同的遺傳背景，同時又存在遺傳分化上的差異。

圖3 杜鵑Nei’s遺傳距離UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA dengrogram for Rhododendrons based on Nei’s genetic distance

品種分類是物種演化的表現方式，既要反映出種質資源的進化關系，又要能切合實際應用。分子標記技術是可以快速準確地對植物材料進行分類鑒別的技術，玉米、偃麥草、甜瓜、小麥、油茶[16-20]等大量植物已經成功運用分子標記進行了品種性狀鑒定與改良，對于提高這些植物資源的利用提供了科學依據。除品種鑒定外，ISSR對種間的遺傳差異分析也有不可替代的作用，李單騎等[21]運用ISSR研究福建柏的遺傳多樣性，將不同地區的福建柏種群進行了分類；田艷伶等[22]對鉤栗的9個野生居群進行ISSR分析并對其進行了分類，這些研究都對各自區分種間親緣關系有重要意義。在杜鵑方面，大量前人成功運用RAPD分子標記技術進行了杜鵑品種鑒定[23-25]、運用AFLP不同引物組合數對馬纓杜鵑遺傳多樣性的影響進行準確分析，完善了該種杜鵑在AFLP技術中的擴增體系，使得該品種鑒定更加準確[26]。此外還有研究利用ISSR技術對牛皮杜鵑、福建杜鵑花、鹿角杜鵑進行了遺傳多樣性分析并進行分子鑒定[27-29]。

然而UPGMA聚類分析只能說明不同種之間遺傳關系的遠近，并不能完全反應出各個聚類中的共同特征。傳統的杜鵑分類是根據杜鵑表型和來源將其分為5類：東鵑、西鵑、毛鵑、夏娟、高山杜鵑。周泓[30]在此基礎上通過AFLP和SSR標記分別對國內常見的66個杜鵑品種和野生130個杜鵑種進行分類，其結果基本與傳統分類相符，聚類的品種中，第一級分類標準為株型，第二級為瓣類，第三級為花型，與本研究的結果以花型分類而不以葉質分類相近，因此筆者支持該文中所提出的分類標準。

杜鵑花的野生品種接近1 000種，園藝雜交品種更是近10 000種，其種類之豐富令人感嘆，本實驗所選取的28種杜鵑相對于上述總量來說只是九牛一毛。本實驗所選取的是當年生枝條上的幼嫩葉片，由于受到采樣時間、地點等因素限制，遺憾的是未能取得更多的實驗樣本，無法確定更多種之間的遺傳關系；實驗對象也僅限于葉片，豐富性不夠，實驗結果有一定的局限。為了建立杜鵑種之間更加完善的分類體系，筆者認為有必要在今后的實驗過程中對杜鵑花種進行系統的樣本采集，包括花、葉、果實、種子等，以保證材料的豐富性和多樣性。同時逐漸擴充其種量，從湖南省森林植物園到長沙市到湖南省甚至全國，不斷擴大研究的范圍，為杜鵑花的分類研究提供準確而充足的儲備研究。

目前，我國在園藝花卉品種的資源管理、引種以及繁育方面尚不完整，且杜鵑屬為異花授粉植物，加之杜鵑品種在遺傳過程中受到環境因素的影響，使得該屬植物之間基因變化幾率突增，僅靠傳統的形態學分類已難以區分。本研究利用ISSR分子標記很好地區分出各品種間的差別，說明ISSR分子標記技術能較有效地反映杜鵑品種的進化歷程及演變情況，同時也能將該技術應用到杜鵑新品種鑒定、新種質資源劃分、雜交親本判定與表型性狀辨別等領域，應用前景廣闊。當然，ISSR分子標記的實驗結果可能會受到試驗樣本、試驗方法和試驗操作等客觀條件的影響，并不能完全取代傳統的分類方法。因此，只有綜合分子標記技術和傳統的形態學分類才能快速、準確地對植物進行鑒別、分類。

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