日本海棠花粉最佳離體萌發培養基篩選及萌發過程研究

，2

（1.南京林業大學 a.林學院；b.南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210037；2.揚州小蘋果園藝有限公司，江蘇 揚州 225200）

觀賞海棠Malusspp.是薔薇科Rosaceae蘋果屬Malus落葉小喬木，一般是人工選擇培育的一系列品種的總稱，多為落葉小喬木，是優秀的景觀樹種。中國海棠自18世紀傳入歐洲后備受重視，通過不斷地收集和選種，相互雜交育種，已培育出許多受歡迎的觀賞海棠品種[1]。在美國和加拿大的園林景觀植物名錄中可以見到的海棠栽培種有500多個[2]。育種上，常通過不同花期與花色品種的雜交組合來延長海棠花的觀賞期、保持花色的穩定性及豐富觀賞海棠的花色和花型，目前我國觀賞海棠資源和歐美原種已進行了多次雜交，已培育出大量的觀賞海棠新品種，如‘紅纓’M.‘Hongying’[3]‘碩果海棠’M.‘Shuoguohaitang’[4]和‘繾綣’M.‘Qianquan’[5]等。日本海棠M.Floribunda作為花量極大的觀賞海棠原生種，是雜交育種的極佳父本材料。

花粉活力的測定是開展育種工作的基礎，而林木檢測花粉活力的方法有很多種[6]，其中以TTC、FCR等染色法可以判別其顏色，但結果存在較大誤差。王旭軍等[7]對臺灣榿木Alnus formosanaL.花粉的染色鑒定結果表明，TTC幾乎無法使材料著色。Stanley等[8]認為，花粉離體萌發法，提供的條件與花粉在柱頭萌發的條件更為接近，這是檢測花粉活力最為可靠的方法。離體萌發測定法，根據花粉離體培養時的萌發率判定其生活力，簡單、迅速、合理，并可完全定量，但要在一定的溫度和培養條件下進行。有關研究結果表明，蔗糖[9]、硼酸[10]、Ca2+[11]在離體萌發試驗中對花粉的萌發與花粉管的生長均有不同程度的促進作用。張鮮鮮等[12]、史峰厚等[13]分別采用10%蔗糖＋0.2%～0.3%硼酸＋1.0%和0.6%的瓊脂＋10%蔗糖＋2.0%硼酸，在25 ℃等溫度下培養研究不同海棠品種的萌發率，然而并沒有通過系統的試驗設計來深入探討不同培養基處理對海棠花粉萌發率及花粉管長度的影響情況。因此，開展觀賞海棠花粉離體萌發培養研究以確定適于萌發的最佳培養基，對于觀賞海棠雜交育種研究具有重要意義。為給觀賞海棠雜交育種提供參考依據，本研究采用花粉離體萌發法，對日本海棠花粉活力進行了測定，研究其適宜的培養基，探討并觀察了觀賞海棠花粉離體萌發條件及花粉萌發過程。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

試驗地位于江蘇省江都市仙女鎮（東經119°55′、北緯 32°42′）南京林業大學海棠種質資源圃，屬于北亞熱帶季風氣候，四季分明。年平均氣溫約14.9 ℃，年平均降水量約1 000 mm，無霜期約320 d。試驗地地勢平坦，立地條件一致，土壤為沙壤土，土層深厚肥沃，灌排條件良好。

選取日本海棠M.floribunda7年生健壯無病蟲害的實生苗作為試驗材料。

1.2 試驗設計與試驗方法

1.2.1 試驗設計

單因素試驗設計：試驗均采用液體培養基進行培養，培養基成分分別為蔗糖、硼酸、硝酸鈣，單因素試驗各處理濃度梯度如表1所示。

正交試驗設計：在單因素試驗的基礎上，采用L25(53)正交試驗設計進行試驗。

1.2.2 花粉采集

于盛花期選擇3～5株長勢均勻的樹體，在上午9:00時左右選擇樹體不同部位的枝條隨機采集其花朵，放入硫酸紙袋中帶回實驗室內。用鑷子將花藥取下，置于硫酸紙上，在室內（17 ℃左右）自然陰干，待花藥開裂使用5 mL的指形管收集花粉以備用。

表1 單因素試驗設計的各處理濃度梯度Table 1 Concentration gradient of each treatment under single factor experiment %

1.2.3 花粉離體萌發率的測定

在雙凹載玻片上滴入50 μL培養液，用大頭針蘸取適量花粉使其均勻地散落在培養基上，將載玻片水平置于鋪有濕潤脫脂棉的培養皿內，在25 ℃條件下保濕培養。用OLYMPUS BX43光學顯微鏡進行觀察與統計（單因素觀測統計培養4 h的萌發狀況，最佳培養基的正交試驗結果觀測統計分別培養1、2、3、4、8、12、24、48 h的萌發狀況），每個玻片隨機選取5個不重復的視野，統計萌發率，以花粉管長度大于花粉直徑視為萌發，測定花粉管長度。各試驗均重復4次。

花粉萌發率＝(已萌發花粉數/花粉總數)×100%。

1.2.4 數據分析

采用DPS9.5進行方差分析，采用Duncan法進行多重比較，采用Origin 9.0及Adobe Illustrator CS5作圖。

2 結果與分析

2.1 蔗糖濃度對花粉活力的影響

蔗糖濃度對日本海棠花粉離體萌發的影響情況如圖1所示。從圖1中可以看出，蔗糖濃度對日本海棠花粉離體萌發率有重要影響。在不同濃度的蔗糖培養基中，其平均花粉萌發率表現出顯著差異。當蔗糖濃度為10%時，日本海棠平均花粉萌發率及花粉管長度均到達峰值，分別為55.2%和853.11 μm，且平均花粉萌發率顯著高于其他蔗糖濃度處理（P＜0.01）。然而，在蔗糖濃度分別為10%與15%的培養基中培養的日本海棠，其平均花粉管長度間的差異不顯著（P＝0.120），且蔗糖濃度不論高低，均未造成花粉管的破裂。

圖1 蔗糖濃度對日本海棠花粉離體萌發的影響Fig.1 Effects of different sucrose concentrations onM.floribunda pollen vitro germination

2.2 硼酸濃度對花粉活力的影響

硼酸濃度對日本海棠花粉離體萌發的影響情況如圖2所示。由圖2可知，在一定濃度范圍（0.01%～0.02%）內，日本海棠平均花粉管長度隨著處理濃度的增加而提高。當硼酸濃度達到0.02%時，平均花粉管長度達到1 023.46 μm，顯著高于其他濃度處理（P＜0.01），然而，此時的萌發率卻并未達到峰值；當硼酸濃度為0.04%時，日本海棠平均花粉萌發率最高，達54.4%，此時的花粉管長度為595.07 μm，顯著低于0.02%濃度處理下的平均花粉管長度。方差分析結果表明，當硼酸濃度分別為0.02%和0.04%時，其平均花粉萌發率間無顯著差異（P＝0.278）。

圖2 硼酸濃度對日本海棠花粉離體萌發的影響Fig.2 Effects of different boric acid concentrations onM.floribunda pollen vitro germination

2.3 硝酸鈣濃度對花粉活力的影響

硝酸鈣濃度對日本海棠平均花粉萌發率及花粉管長度的影響情況如圖3所示。由圖3可知，低質量濃度的Ca2+（0.01%～0.02%）處理可促進日本海棠花粉的萌發，當Ca2+濃度大于0.02%時，Ca2+開始抑制花粉的萌發；當Ca2+達到0.3%時，日本海棠花粉則完全失去離體萌發力。當Ca2+濃度為0.02%時，日本海棠平均花粉萌發率及花粉管長度均達到最高值，分別為37.6%和713.74 μm，顯著高于其他濃度處理（P＜0.01）。方差分析結果表明，濃度分別為0.01%與0.02%的Ca2+處理下日本海棠平均花粉萌發率間無顯著差異（P＝0.403）。

圖3 硝酸鈣濃度對日本海棠花粉離體萌發的影響Fig.3 Effects of different Ca2+ concentrations on M.floribunda pollen vitro germination

2.4 正交試驗各處理對日本海棠花粉萌發的影響

根據單因素試驗結果，以對日本海棠花粉萌發影響較大的各因素（蔗糖、硼酸、CaNO3）處理水平進行正交試驗，正交試驗設計組合及試驗結果分別如表2與表3所示。各處理對日本海棠花粉萌發率及花粉管長度的影響不同。其中，13號處理（10%蔗糖＋0.02%硼酸＋0.04%硝酸鈣）的平均萌發率及花粉管長度均最大，培養4 h時分別達到70.1%和777.02 μm，顯著高于除12號處理（10%蔗糖＋0.01%硼酸＋0.03%硝酸鈣）之外的其他各處理的平均花粉萌發率及花粉管長度（P＜0.05）；12號處理的平均花粉萌發率及花粉管長度分別為69.6%及763.39 μm，其與13號處理間的差異不顯著（P＝0.724）。其他各處理的萌發結果表明（表3），平均花粉萌發率超過50%的處理有12個，處理編號分別為2、10、14、15、16、17、18、19、20、22、23、25， 其萌發率均在50%～60.4%之間，其余11個處理（除1和7號處理外）的萌發率在33.7%～49.6%之間，1和7號處理的日本海棠花粉均完全未萌發；平均花粉管長度超過400 μm的處理有15個，其中，平均花粉管長度為500～600 μm的處理有6個，處理編號分別為2、9、15、19、20、23，平均花粉管長度為400～500 μm的處理有9個，處理編號分別為4、14、16、17、18、21、22、24、25，除未萌發的1號和7號處理之外的其余8個處理的平均花粉管長度均在268.7～378.2 μm之間。

表2 影響日本海棠花粉萌發的L25(53)正交試驗設計Table 2 L25(53) Orthogonal design of pollen germination of M.floribunda

2.5 日本海棠花粉離體萌發過程中萌發率及花粉管長度的變化情況

日本海棠花粉在本試驗篩選出的最適培養基（10%蔗糖＋0.02%硼酸＋0.04%硝酸鈣）中培養48 h的萌發過程見圖4。日本海棠花粉在培養第1個小時內花粉并未萌發；培養2～4 h后其花粉萌發率與花粉管長度均保持了較高的增長速率，平均每小時分別達到23.4%與259.01 μm；培養4 h后，花粉萌發速率減慢，培養8 h后花粉萌發速率趨于平穩，其萌發率達到72.5%，此后花粉萌發率間的差異不顯著（P＞0.05）；然而，在培養8～12 h的過程中，花粉管長度仍然保持著較高的增長速度（54.13 μm/h），并在培養12 h后趨于平穩。

3 結論與討論

3.1 討 論

蔗糖是大多數植物花粉離體培養所必需的重要培養基成分[14-15]，其能在花粉離體培養時為花粉管的生長提供營養物質和花粉萌發所需的滲透壓[16]，也為花粉萌發提供營養來源。有關研究結果表明，當培養基的濃度過高或過低時，均會對花粉萌發產生抑制作用。吳開志等[17]、金亞征等[18]在對核桃Juglans regiaL.與仁用杏的花粉離體萌發的觀測中發現，在低體積分數的蔗糖培養基中，部分萌發的花粉管出現了爆裂現象，且伴有內含物的溢出；律春燕等[19]對黃牡丹Paeonia lutea花粉活力的測定結果表明，高濃度的蔗糖（200 g/L）溶液會造成花粉原生質體失水萎縮，質壁分離。在單因素的試驗中發現，當蔗糖濃度為10%時，日本海棠的平均花粉萌發率及花粉管長度均達到峰值，分別為55.2%和853.11 μm，且其平均花粉萌發率顯著高于其他蔗糖濃度處理（P＜0.01）。然而，在以濃度分別為10%與15%的蔗糖培養下日本海棠平均花粉管長度間的差異不顯著（P＝0.120），且蔗糖濃度不論高低，均未造成花粉管的破裂。

表3 影響日本海棠花粉萌發的L25(53)正交試驗結果Table 3 Result of L25(53) orthogonal test of M.Floribunda pollen vitro germination

圖4 日本海棠花粉離體萌發過程中花粉萌發率及花粉管長度的變化情況Fig.4 Pollen germination rate and pollen tube length during M.floribunda pollen vitro germination

硼酸是在花粉離體萌發時所需培養基的另一主要成分[20-21]，其主要作用是參與花粉管頂端細胞壁的形成，對花粉管膜中果膠的合成有著重要作用。在離體培養條件下，適宜的硼酸處理可以有效提高花粉萌發率[22-23]。硼的缺失會造成果膠甲酯酶活性的改變、酸性果膠質在頂端的大量富集，從而導致花粉管破裂，抑制花粉萌發與花粉管的伸長[24]。本研究結果表明，當硼酸濃度分別為0.02%和0.04%時，日本海棠的平均花粉管長度和花粉萌發率均達到峰值，分別為1 023.46 μm和54.4%，顯著高于其他濃度處理（P＜0.01），而在此兩種濃度處理下其平均花粉萌發率間無顯著差異（P＝0.278）。

硝酸鈣在花粉管的極性生長中有著極為重要的作用[25]，花粉管尖端為Ca2+集中聚集的區域[26]，其向花粉管尖端的內流十分活躍[27]，Ca2+的動態平衡影響花粉的萌發與花粉管的頂端生長，許多研究者都認為，一定濃度的外源Ca2+可以促進花粉的萌發，而當內源Ca2+充足時，高濃度的Ca2+則會抑制花粉的萌發及花粉管的生長[28-29]。本研究結果表明，低質量濃度（0.01%～0.02%）的Ca2+可促進日本海棠花粉的萌發；而當Ca2+濃度大于0.02%時，硝酸鈣開始抑制花粉的萌發，當Ca2+達到0.3%時，日本海棠花粉則完全失去離體萌發力。當Ca2+濃度為0.02%時，日本海棠的平均花粉萌發率及花粉管長度均最高，分別為37.6%和713.74 μm，顯著高于其他處理（P＜0.01）。方差分析結果表明，濃度分別為0.01%及0.02%的Ca2+處理的日本海棠其平均花粉萌發率間無顯著差異（P＝0.403），說明外加的Ca2+抑制了花粉的萌發或更適宜的Ca2+質量濃度應在0.00%～0.01%之間。有些研究結果表明，花粉萌發時并不需要外源Ca2+的存在[30-31]。

前人研究結果表明，綜合多種成分的培養基可以增加花粉的萌發率。詹妮等[32]在對大葉相思花粉萌發適宜條件的研究中發現，以200 g/L蔗糖＋300 mg/L硼酸為培養基，培養溫度為30 ℃時最適宜大葉相思花粉的萌發，其萌發率達到98.26%；金亞征等[18]對仁用杏花粉離體萌發的正交試驗研究結果表明，0.1 g/L瓊脂＋1 g/L蔗糖＋0.003 g/L硼酸＋0.000 g/L二水合氯化鈣＋ 0.000 6 g/L赤霉素的組合培養基為其最佳培養基，其萌發率達到38.8%，高于其他單因素處理；王湘南對湖南種源油茶良種花粉萌發的研究結果表明，其最適培養基為1%瓊脂＋10%蔗糖＋0.015%硼酸的組合培養基，其萌發率高于其他處理[33]。本研究中發現，10%蔗糖＋0.02%硼酸＋0.04%硝酸鈣為日本海棠離體萌發正交試驗各處理中最適宜培養基，其萌發率達到70.1%，顯著高于單因素試驗萌發率最高處理（蔗糖10%）（P＝0.000 3）。

李民[34]在對山杏Prunus sibirica花粉離體萌發的研究中將花粉管在培養基中的生長過程劃分為4個時期，其中，培養0.6～2.0 h為其快速生長期；而安曉芹[35]對4個杏品種花粉離體萌發培養的研究結果表明，不同品種花粉大量萌發的時間及生長期之間均有差異，花粉大量萌發的時間及快速生長期分別在培養0～10及0～8 h內。本研究中發現，日本海棠的花粉萌發過程與上述樹種的萌發特點存在差異，在以最佳培養基處理下的花粉萌發試驗結果表明，日本海棠花粉在培養的第1個小時內其花粉并未萌發，培養2～4 h后其花粉萌發率與花粉管長度則均保持了較高的增長速率，平均每小時分別達到23.4%與259.01 μm。在培養4 h后，花粉萌發速率減慢，并在培養8 h后趨于平穩，其萌發率達到72.5%，此后花粉萌發率的差異不顯著（P＞0.05），然而在培養8至12 h的過程中，花粉管長度仍然保持著較高的增長速度（54.13 μm/h），并在培養12 h后趨于平穩，說明花粉萌發率和花粉管的快速增長期分別在培養2～8和2～12 h之間。

3.2 結 論

本研究結果表明，日本海棠在不同離體培養基中的萌發狀況不同，其最適離體培養基為10%蔗糖＋0.02%硼酸＋0.04%硝酸鈣，其平均花粉萌發率及花粉管長度分別達到70.1%和777.02 μm，花粉萌發過程中，培養第1個小時后開始萌發，且培養2～4 h為其離體快速萌發階段。這一研究結果對今后有關其雜交育種父本品種篩選等方面的研究具有參考價值。

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