不同精粗比日糧對山羊瘤胃、瓣胃上皮生長的差異性研究

盧勁曄，趙懷寶，顧蓓蓓，馮 晴，張 磊，許 君，沈贊明*

（1.南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2.江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300；3.連云港東海縣動物衛生監督所，江蘇 連云港 222300）

反芻動物的胃是復胃，由4個胃室組成，分別是瘤胃、網胃、瓣胃和皺胃。其中，瘤胃與瓣胃為反芻動物主要的消化吸收場所。日糧添加精料比率對反芻動物前胃的生長發育起到重要的作用。在山羊與牛的研究中發現，與單純飼喂粗料日糧相比，添加精料飼喂可以提高瘤胃重量，促進瘤胃乳頭發育，增大瘤胃乳頭橫切面積[1-3]。大多數研究主要集中在瘤胃，研究表明高精料日糧提高瘤胃VFA含量，促進瘤胃上皮生長發育。然而，關于日糧營養對瓣胃生長影響的研究較少。本實驗室前期研究發現，提高精料飼喂比率后，瘤胃重量提高，而瓣胃重量下降[4]。本試驗擬進一步探索不同精粗比日糧引起山羊瘤胃、瓣胃上皮生長差異的機理。

1 試驗設計

1.1 動物飼養

本試驗動物選用健康的青年波雜山羊（90～120日齡）16只。試驗開始前適應2周時間，期間對山羊進行驅蟲，山羊自由采食及飲水，逐漸增加精料飼喂量至400 g·d-1。試驗開始后，根據體重相近及公母對半原則，隨機分為粗料組（PS組，n=8）和粗料+精料組（PSC組，n=8）。試驗期間自由飲水及采食花生桿；PSC組每天飼喂精料400 g，飼喂持續42 d，第43天屠宰取樣，日糧營養水平見表1。

表1 日糧營養水平 DM

1.2 樣品采集

山羊屠宰后取瘤胃、瓣胃上皮，用預冷的PBS（pH 7.4）反復沖洗，再用吸水紙擦干，部分樣品用10%福爾馬林溶液固定，部分樣品置于液氮保存。

1.3 上皮組織形態學觀察

1.3.1 上皮組織切片制作

采用石蠟切片法觀察瘤胃與瓣胃上皮組織形態。10%福爾馬林溶液固定24 h后，采用梯度酒精脫水，再將組織投入二甲苯中透明10～15 min，60℃石蠟包埋。冷卻后的蠟塊經修塊后再用切片機切片，切片厚度5 μm。采用H.E染色法染色。

1.3.2 上皮細胞形態學分析

每只山羊的瘤胃及瓣胃樣品均取3個蠟塊，每個蠟塊精選3張非連續切片，每張切片分別讀取3個不同區域，再取平均值。采用Image-Pro Plus 8.0分析系統讀數上皮細胞層數。

1.4 上皮細胞細胞周期檢測

1.4.1 上皮細胞的分離與固定

取出山羊瘤胃及瓣胃上皮組織，清洗干凈后，剪取組織塊（約500 mg）置于燒杯中，D-Hanks溶液漂洗3～4次；再加入胰酶37℃水浴消化；30 min后棄去上清液，再取出上皮組織。重復上述消化步驟3～4次。將處理后的上皮組織置于另1個干凈燒杯中，繼續加入胰酶消化10～15 min，顯微鏡鏡下觀察所得細胞大部分為圓形時進行收集，收集液中加入1滴小牛血清以終止消化。收集液1 500 r·min-1離心10 min后得細胞沉淀，再用PBS洗滌細胞沉淀，加入2 mL預冷的75%酒精重懸細胞，混勻后4℃保存待測。

1.4.2 碘化丙啶染色與流式細胞分析

將75%酒精固定的上皮細胞1 500 r·min-1離心10 min。細胞沉淀用PBS 50 μL重懸，再加入碘化丙啶染液500 μL，震蕩混勻后置于室溫避光染色20 min，再用流式細胞儀檢測細胞周期。每個樣品計數10 000～12 000個細胞，用ModFit軟件分析結果。

2 試驗結果

2.1 山羊瘤胃與瓣胃重量

山羊瘤胃與瓣胃重量見表2。

由表2可知，PSC組山羊瘤胃干重顯著高于PS組（P＜0.05）；相反，PSC組瓣胃干重顯著低于PS組（P＜0.05）。結果表明添加精料飼喂促進山羊瘤胃生長，卻抑制瓣胃生長。

表2 不同精粗比日糧對山羊瘤胃、瓣胃重量的影響

2.2 瘤胃與瓣胃組織形態學觀察

瘤胃上皮組織形態學變化如圖1所示。從黏膜面向漿膜面分為角質層（SC）、顆粒層（SG）、棘突層（SS）和基底層（SB）。角質層由多層角質化細胞構成，細胞呈扁平狀，細胞核及細胞器完全退化，細胞染色較深；顆粒層細胞細胞呈梭形，細胞核呈橢圓形，染色較淺；棘突層細胞較大，細胞核呈圓形；基底層又稱為生發層，由1～2層立方形細胞排列而成，細胞體積較小，排列整齊，細胞核染色較深。瓣胃上皮細胞組成及形態與瘤胃相似，見圖2。

2.3 瘤胃與瓣胃上皮細胞層數

日糧粗精比例對山羊瘤胃、瓣胃上皮細胞層數的影響見表3。

由表3可知，與PS組相比，PSC組山羊瘤胃上皮顆粒層和棘突層細胞總層數顯著升高，而PSC組瓣胃上皮顆粒層和棘突層細胞總層數顯著降低（P＜0.05）。結果表明，添加精料飼喂促進增加瘤胃上皮細胞層數，卻減少瓣胃上皮細胞層數。

2.4 瘤胃與瓣胃上皮細胞周期

日糧粗精比例對山羊瘤胃、瓣胃上皮細胞周期的影響見表4。

由表4可知，PSC組山羊瘤胃上皮細胞S期和G2/M期細胞百分率均顯著高于PS組（P＜0.05）；而PSC組山羊瓣胃上皮細胞S期和G2/M期細胞百分率均顯著低于PS組（P＜0.05）。結果表明，添加精料飼喂加速瘤胃上皮細胞周期G1期進程，促進細胞增殖，而添加精料比率卻抑制瓣胃增殖。

圖1 瘤胃上皮乳頭切片

圖2 瓣胃上皮組織切片

表3 日糧粗精比例對山羊瘤胃、瓣胃上皮細胞層數的影響

表4 日糧粗/精比例對山羊瘤胃、瓣胃上皮細胞周期的影響 %

3 討論

研究發現日糧添加精料加速瘤胃上皮細胞增殖，促進瘤胃上皮細胞生長。早在20世紀50年代，就有研究報道了日糧添加精料增大犢牛瘤胃體積，促進瘤胃乳頭發育[5]。后續研究表明日糧添加精料促進青年奶牛瘤胃乳頭生長，此結果是由飼料的高能量水平而并非飼料物理性狀引起的[6]。但這些試驗僅限于高能量日糧促進瘤胃上皮乳頭增大的表觀指標，而不清楚其機理。

本試驗研究發現，日糧添加精料促進瘤胃上皮生長是通過縮短瘤胃上皮細胞周期進程，減速細胞增殖實現的。本試驗中，瓣胃上皮結果與瘤胃相反，純粗料日糧加速瓣胃上皮細胞增殖，促進瓣胃上皮細胞生長。此結果與在鼠結腸的一項研究結果類似，日糧添加纖維素比率可以降低降低G0/G1期細胞比率、提高S期細胞比率，促進細胞增殖[7]。不同精粗比率日糧對瘤胃、瓣胃上皮生長的差異性可能與瘤胃、瓣胃結構及功能的差異相關。

瘤胃中日糧的消化主要由微生物完成，瘤胃內微生物將食物發酵產生短鏈脂肪酸后被瘤胃上皮吸收；瓣胃的主要表現為“篩網”作用，通過瓣胃肌肉的劇烈收縮將大顆粒食物研磨成細小的顆粒；因而瓣胃上皮的發育可能對進入瓣胃食物的物理性狀依賴性較強，但其具體機制還需進一步研究加以證明。

[1] Mcclure K E,Solomon M B,Loerch S C.Body weight and tissue gain in lambs fed an all-concentrate diet and implanted with trenbolone acetate or grazed on alfalfa[J].Journal of Animal Science,2000,78(5):1 117-1 124.

[2] Weigand E,Young J W,Mcgilliard A D.Volatile fatty acid metabolism by rumen mucosa from cattle fed hay or grain[J].Journal of Dairy Science,1975,58(9):1 294-1 300.

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[7] Lupton J R,Coder D M,Jacobs L R.Long-term effects of fermentable fibers on rat colonic pH and epithelial cell cycle[J].Journal of Nutrition,1988,118(7):840.