豬偽狂犬病病毒滅活疫苗工藝研究

李洪艷，鞏福麗

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

目前，豬偽狂犬病病毒滅活疫苗的生產主要是轉瓶細胞培養的傳統培養方式，進而增殖豬偽狂犬病病毒[1-2]。但轉瓶培養細胞增殖較緩慢且生產過程中對細胞和病毒培養條件，如pH、溶氧、糖耗等難以監控和適時補給，無法提供最佳的培養條件，造成該方法自動化程度低、勞動強度大，并因為轉瓶細胞培養環境的不可控性，導致產品質量穩定性不夠，批間差較大。另外提高病毒毒價，保證良好的臨床效果是解決豬偽狂犬病病毒滅活疫苗產業化的當務之急。而用生物反應器替代轉瓶生產疫苗株則克服了上述不足，成為前景最好的豬偽狂犬病病毒滅活疫苗生產技術之一[3-5]。

1 材料與方法

生物反應器：美國Wave Biotech公司WAVE波浪生物反應器；微載體：Cytodex-1（美國通用電氣醫療集團生命科學部）；豬偽狂犬病病毒：購自中國獸醫藥品監察所。

1.1 細胞復蘇培養

用方瓶培養從液氮罐中復蘇的ST細胞，培養條件為：pH 7.2，溫度37℃，培養48～72 h，形成良好細胞單層時，用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養。該過程中使用的培養基為MEM，血清為胎牛血清，使用量為8%。

1.2 微載體處理

按培養的終體積稱取微載體適量，用無Ca2+、Mg2+-PBS室溫浸泡過夜，棄去PBS，再用無Ca2+、Mg2+-PBS洗1次，棄去，最后加入無Ca2+、Mg2+-PBS高壓滅菌。115℃、10 psi、15 min。

1.3 微載體培養

用EDTA-胰酶細胞消化液制備細胞懸液，細胞計數后按2×105個·mL-1的密度接種到細胞培養袋中進行培養。培養的方法參數為：微載體濃度為2 g·L-1、DO值50%、溫度37℃、擺動角度7°擺動速度16 r·min-1。在培養過程中監控細胞培養袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的產生，同時在不同的節點上細胞計數（Cytodex1上的細胞計數先用PBS漂洗2次，經0.1%結晶紫的檸檬酸溶液染色，用血球計數板計數細胞核），當細胞的密度達到1×106～2×106個·mL-1時開始灌注，依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7～2個工作體積的速度，以維持細胞的生成。

1.3.1 細胞接種密度的確定

當微載體的用量為2 g·L-1，分別以5×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105個·mL-1的接種密度接種ST細胞，每天取樣分析。不同接種密度細胞生長情況見表1。

表1 不同接種密度細胞生長情況 個·mL-1

由表1可知，當微載體含量相等，不同的接種密度對ST細胞生長影響較大。以5×104、1×105個·mL-1接種時，接種后5 d仍在緩慢生長，沒有進入穩定生長期的明顯標志；以2×105、3×105、4×105、5×105、6×105個·mL-1接種時，ST細胞在接種后第2 d進入穩定生長期；從表1的數據的可知，隨著細胞接種密度的增高，ST細胞生長速度的增加并不與細胞接種密度增加保持同步；當ST細胞接種密度為2×105個·mL-1時，ST細胞在第4和5天后的生長速度要明顯高于其他接種密度的生長速度，因此，優選采用2×105個·mL-1的接種量接種ST細胞。

1.3.2 微載體含量的確定

細胞接種密度與微載體含量對細胞生長的影響密切相關，其中重要的標志是接種時要保證合適的細胞密度與載體的比例關系。

在每g微載體接種相同ST細胞數的前提下，考察Cytodex 1含量為1、2、3、4、5、6、7和8 g·L-1時ST細胞生長情況，用來確定合適的載體用量。不同微載體含量細胞生長情況見表2。

由表2可知，隨著微載體含量的增加，ST細胞密度會有所增加，但ST細胞擴增倍數有所降低。微載體含量為2 g·L-1時，ST細胞生長較快，培養時間為5 d時，ST細胞密度達到了1.68×107g·L-1，高于其他的微載體的細胞密度；此外，當微載體含量＞2 g·L-1時，ST細胞生長的增加速度不顯著。因此，在細胞培養袋中培養ST細胞時，所加入的微載體的含量優選為2 g·L-1。因此綜合考慮，本試驗微載體含量采用2 g·L-1。

1.3.3 搖動條件的確定

以2 g·L-1的含量加入微載體，以2×105個·mL-1密度接種ST細胞，加入細胞培養基培養，擺動角度分別為5、6、7、8、9°；擺動速度分別為12、14、16和18 r·min-1，每d取樣，觀察微載體上細胞吸附和生長情況，考察搖動條件對細胞培養的影響。不同搖動條件下細胞生長情況見表3。

表2 不同微載體含量細胞生長情況 個·mL-1

表3 不同搖動條件下細胞生長情況 個·mL-1

由表3可知，整個培養過程，搖動條件對細胞的密度影響較大。結果表明，當搖動條件為擺動角度7°、擺動速度16 r·min-1時，在此搖動條件下細胞的生長速度要遠高于其他的搖動條件。因此，搖動條件優選為擺動角度7°、擺動速度16 r·min-1。

1.4 病毒液的增殖

當細胞培養到達第4天時沉降微載體，排出細胞培養袋中液體，加入PBS洗滌細胞，重復洗滌3次，加入病毒維持液并接種豬偽狂犬病病毒，其中病毒接種劑量為3%、病毒增殖的培養基為含1%血清的MEM，pH 7.4，溫度35℃。接毒后每隔一定時間取生物反應器中的微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，并檢測樣品TCID50，當微載體上的細胞大部分脫落，停止培養，收獲病毒液，于-20℃凍融兩次，得到豬偽狂犬病病毒液。

1.4.1 病毒含量的測定

利用TCID50方法進行病毒含量的測定。病毒TCID50測定時，以MEM培養液將培養得到的豬偽狂犬病毒液作連續10倍稀釋，即10-1、10-2……10-8，每個稀釋度取100 μL加入96孔細胞培養板的孔中，隨后加入經胰蛋白酶-EDTA消化分散的ST細胞懸液，每孔100 μL（細胞含量約3×105·mL-1為宜），每個稀釋度作8個重復，并設正常細胞培養對照，置5%CO2培養箱中，37℃培養，逐日觀察細胞病變和對照，共觀察2～4 d，并記錄細胞病變的孔數，Reed-Muench法計算病毒的TCID50。同時以相同的方法對用轉瓶培養的豬偽狂犬病毒液進行TCID50測定。以此作為對照組。

2 試驗結果

2.1 豬偽狂犬病病毒病毒含量

豬偽狂犬病病毒病毒含量見表4。

由表4可知，利用生物反應器培養的豬偽狂犬病毒液病毒含量不小于轉瓶培養的豬偽狂犬病毒液病毒含量。由此可見利用生物反應器培養的病毒要明顯優于轉瓶培養的病毒。

2.2 病毒維持液血清濃度的確定

分別選擇0.5%、1%、1.5%、2%血清濃度維持液，培養結束后，分別對含毒細胞培養液的病毒含量進行測定，以確定最佳血清濃度的維持液。不同血清濃度維持液對病毒增值的影響見表5。

表4 豬偽狂犬病病毒含量

表5 不同血清濃度維持液對病毒增殖的影響

由表5可知，血清濃度對病毒的增值有一定影響，當血清濃度為1%時，病毒含量為107.6TCID50/0.1 mL，明顯高于血清濃度為0.5%時的病毒含量。因此選擇血清濃度為1%的維持液培養病毒。

2.3 病毒液滅活及乳化制成疫苗

收獲病毒液用二乙烯亞胺（BEI）滅活，BEI終濃度0.03%，30℃滅活72 h。滅活后的豬偽狂犬病毒液加入常規油性佐劑，攪拌混勻，制得油乳劑疫苗。

2.4 疫苗的安全性試驗

試制3批疫苗，接種約18 g小白鼠10只，接種0.3 mL·只-1，觀察14 d；接種初生仔豬、斷奶仔豬及妊娠母豬，2 mL·頭-1，超劑量接種10 mL·頭-1，接種后未見對生殖功能有任何影響，體溫、進食、配種、妊娠、產仔均正常。試驗結果表明，滅活疫苗安全性良好。

2.5 疫苗免疫原性比較

取豬偽狂犬病毒血清中和抗體陰性的斷奶仔豬30頭，分為3組，10頭·組-1，組1免疫接種試制豬偽狂犬病滅活疫苗，肌肉注射，3 mL·頭-1；組2免疫接種傳統轉瓶制備的豬偽狂犬病滅活疫苗，肌肉注射，3 mL·頭-1。組3為非免疫對照。接種疫苗后觀察6個月，分別于接種疫苗后的7、14、21、30、90、120、150及180 d，采血，測定血清中豬偽狂犬病毒中和指數，比較兩種疫苗的抗體消長規律及免疫持續時間。接種疫苗后豬偽狂犬病毒血清抗體中和指數測定結果見表6。

表6 接種疫苗后豬偽狂犬病毒血清抗體中和指數測定結果

免疫接種6個月后，3個試驗組均用相同劑量的豬偽狂犬病病毒強毒株攻擊，滅活疫苗對豬偽狂犬病病毒強毒攻擊的免疫保護力見表7。

由表7可知，反應器苗免疫豬血清中和抗體于免疫后14 d＞316，于30 d＞1 000，之后抗體水平開始下降，于180 d進行強毒攻擊，保護率為100%；轉瓶苗免疫豬血清中和抗體于免疫后21 d＞316，于30 d＜1 000，于180 d進行強毒攻擊，保護率為80%，由此可以得出，反應器所制備的滅活疫苗對于豬有良好的免疫保護效果，且免疫保護效力要顯著優于傳統轉瓶制備的滅活疫苗對豬的免疫保護效力。

表7 滅活疫苗對豬偽狂犬病病毒強毒攻擊的保護力

[1] 陳煥春,金梅林,何啟蓋,等.豬偽狂犬病油乳劑滅活疫苗的制備及安全性與免疫性試驗[J].畜牧獸醫學報,2001,32（1）:44-51.

[2] 潘潔,何錫忠,張婉華,等.豬偽狂犬病油乳劑滅活疫苗免疫效力試驗[J].上海畜牧獸醫通訊,2014（4）:61.

[3] 龍曉婷.偽狂犬病毒在潛伏感染豬體內的組織分布[D].武漢:華中農業大學,2007.

[4] 位玉玲.唾液中豬偽狂犬病毒熒光定量PCR和ELISA檢測方法的建立與初步應用[D].杭州:浙江農林大學,2017.

[5] 趙麗,崔保安,陳紅英,等.實時熒光定量PCR檢測偽狂犬病病毒方法的建立與初步應用[J].中國獸醫學報,2009,29（4）:433-436.