基于響應面法的微波輔助酶法提取核桃樹葉單寧

（焦作職工醫學院，河南焦作454000）

單寧作為一種廣泛分布于植物中的多酚羥基結構化合物，水溶性好，不僅可與金屬離子發生反應生成穩定的螯合物，同時還能與蛋白質、多糖、生物堿等發生反應[1]。單寧作為一種較高功能價值的植物提取物，在預防與治療自由基所引起的疾病、抑制脂質、抗艾滋病等方面顯示出獨特的優越性[2]，尤其是其所具有的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抑菌性等功能使其成為研究的熱點[3]。廣泛應用于醫療衛生、食品保健等多個領域。

目前，國內外單寧的生產多采用有水提取法、溶劑提取法、超臨界流體萃取法等[4]。不僅提取時間長，單寧的生物活性也難以保證，抗氧化性能較弱。生物酶解技術是近年來發展起來的新型提取方法，通過生物酶破壞植物細胞結構，使胞內物質更易溶解、擴散，進而達到有效提取的目的，具有條件溫和、提取物生物活性高等優點[5]。同時，微波輻射有機物提取技術，通過將能量快速傳遞，可加速細胞內有效成分的快速溶出，提高其反應活性[6]，從而提高酶解得率。近年來，生物降解與微波輻射技術由于符合“環保、綠色”要求而發展迅速。而響應面試驗方法（response surface methodology，RSM）則可對試驗結果進行有效優化[7]，獲取最佳工藝。

本研究基于“綠色化學”的基本原則，以資源豐富的核桃樹葉為原料，采用微波輔助纖維素酶法提取核桃樹葉單寧。并通過RSM對提取工藝進行優化，擬提高得率，同時對所提取單寧的抗氧化性進行探討。為從樹葉中提取單寧、并確保單寧的活性提供一種切實可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

核桃（Juglans regia L.）樹葉：采自山西省呂梁；纖維素酶（2×104U/mL）：諾維信生物技術有限公司（中國）；乙酸鋅、乙醇、乙二胺四乙酸、鉻黑T等試劑均為分析純。

FH102微型植物試樣粉碎機：湖北省黃驊市齊家務科學儀器廠；MKX-H1C1B常壓微波合成/萃取反應工作站：青島邁可威微波創新科技有限公司；SHY-2A水浴恒溫振蕩器：常州金壇市開發區吉特實驗儀器廠；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀：島津企業管理（中國）有限公司。

1.2 提取方法與檢測

1.2.1 原料預處理

用蒸餾水將核桃樹葉洗凈后放入鼓風干燥箱，在70℃溫度下烘干至恒重，再用微型植物試樣粉碎機破碎至50目。取粉末3.0 g，按1∶12的料液質量比配置后置于常壓微波合成/萃取反應工作站，在設定的微波功率下處理一定時間后冷卻至40℃，得到預處理液。

1.2.2 單寧的提取

加入一定質量分數的纖維素酶于預處理液中，然后加入200 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，調節pH值后放入常壓微波合成/萃取反應工作站中，在一定的工藝條件下進行酶解后再提取一段時間，再冰浴冷卻至室溫，然后經減壓、抽濾、干燥、粉碎得到核桃樹葉單寧粗提物。同時，采取無微波輔助的條件下進行對比試驗。

1.2.3 單寧含量測定

參照參考文獻[8]中所提供的方法、采用乙酸鋅絡合滴定法測定單寧的含量。

式中：m1為純化樣品中單寧的量，mg；m2為絕干核桃樹葉總質量，mg。

1.2.4 清除自由基能力檢測

單寧對·OH、ABTS+·和DPPH·等自由基的清除能力檢測參照參考文獻[9]所提供的方法進行。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

以核桃樹葉單寧的得率為指標，在探索性試驗的基礎上，采用單因素試驗，考察微波功率、微波處理時間、酶解溫度、酶解時間、酶液用量和緩沖液pH值對單寧得率的影響，以確定提取單寧的最佳條件。

2.1.1 微波功率和處理時間的影響

在溫度60℃、酶液用量0.9%和緩沖液pH值為4的條件下將預處理液酶解100min。然后在微波功率分別為180、220、260、300 W的條件下進行提取，不同微波提取時間下單寧得率的變化關系見圖1。

圖1 微波處理時間和功率對單寧得率的影響Fig.1 Effects of microwave treatment time and powers on the tannin extraction yield

由圖1可知，微波功率對單寧的得率有較大影響，隨著功率的升高，單寧得率不斷升高。但12min后，功率為260 W的得率與300 W的相接近，考慮到生產成本，將功率確定為260 W。同時，從圖1中還發現，當功率為260 W時，12min后，單寧得率增幅趨緩，隨著時間的延長，得率曲線幾乎接近水平。這是因為微波能使有液泡類的細胞瞬間膨脹破碎而將胞內物質釋放出來，在提取初期，時間越長，胞內物質釋放物越多[10]，單寧的得率也就越高，隨著時間的延長，胞內釋放物的含量逐漸減少，單寧得率增加不明顯。故將微波處理時間確定為12min。

2.1.2 緩沖液pH值和酶解時間對得率的影響

選取微波功率260 W、微波處理時間12min、酶解溫度60℃及酶液用量0.9%，考察不同酶解時間和緩沖液不同pH值對單寧得率的影響見圖2。

圖2 緩沖液pH值和酶解時間對得率的影響Fig.2 Effects of buffer solution pH value and enzymatic time on the tannin extraction yield

結果如圖2所示，在酶解時間為100min、緩沖液pH值為4.0左右時的核桃樹葉單寧得率較高，而pH值低于或超過4.0后均較小。這可能是由于pH值為4.0左右時酶的活性較好的緣故，因此確定pH值為4.0。隨著提取時間的延長，單寧得率逐漸增加，但當酶解時間超過100min后單寧得率降低。這可以解釋為：一方面，隨著提取時間的延長，單寧溶出的同時其它物質的溶出量也會增加。另一方面，提取時間過長也易使部分單寧類物質受到氧化等因素的影響而遭到破壞，從而導致得率降低[11]。故在本試驗中選擇100min作為酶解時間較為合適。

2.1.3 酶解溫度和酶液用量對得率的影響

酶解溫度對單寧的活性與得率等有直接關系。選取50、55、60℃和65℃作為酶解溫度，在酶解時間100min、緩沖液pH值為4.0、微波功率260 W和微波處理時間12min的條件下進行試驗，不同酶解溫度和酶液用量與核桃樹葉單寧得率的關系見圖3所示。

圖3 酶解溫度和酶液用量對得率的影響Fig.3 Effects of enzymatic temperature and enzyme solution dosages on the tannin extraction yield

從圖3中可見，相同條件下，酶解溫度為60℃時得率最高。這是因為隨著溫度升高，酶的活性逐步增強，這有利于促進細胞壁水解。但是溫度過高之后，酶活力會有所下降，部分酶甚至會失活，從而影響得率[12]。由此可見，并不是酶解溫度越高越好，故在本試驗中選取60℃作為酶解溫度。在60℃時，酶液用量較低時，單寧的得率隨著酶液用量的增加而增加明顯，當酶液用量超過0.9%時，單寧得率增加緩慢。這可以解釋為當酶的用量較大時，部分酶不能充分發揮作用所致。

2.2 響應面試驗分析與優化

2.2.1 響應面試驗設計

為了使單寧提取工藝更加合理與科學，在單因素試驗的基礎上，采用響應面試驗方法（RSM）進行多因素的試驗設計：以提取單寧得率為考查目標，選取微波功率、酶液用量、微波處理、酶解時間4個有重要影響的因素進行設計，見表1所示。

表1 響應面試驗設計Table 1 RSM experiment design

根據單因素的試驗結果，選取在酶解溫度和緩沖液pH值分別為60℃和4.0，根據表1中的設計方案進行響應面試驗，響應面試驗結果見表2所示。

2.2.2 多元回歸模型分析與驗證

根據Box-Behnken設計原則，運用Design-Expert

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of RSM

7.1.6軟件進行二次多元回歸分析，得到如表3所示的模型與方差。

續表3 模型與方差Continue table 3 Model and variance

從表3中可知，模型的P值＜0.000 1，表現為非常顯著，而失擬項P＞0.05，表現為不顯著，且復相關系數R2=0.929 1，接近1，這表明模型與實際情況吻合程度較高。同時，AB和BC的P值均小于＜0.05，表現出具有交互作用。

通過響應面分析，可得到回歸方程（2）：

在回歸方程中，4個二次項系數均為負值，表明所選的4個因素均具有最大值，且AB和BC等幾因素具有交互作用，其三維響應面圖見圖4。

圖4 響應面三維圖Fig.4 3D diagrams of RSM

從圖4（a）中可見，隨著酶液用量的增加，單寧得率增加緩慢，這可能是由于酶液達到一定量之后趨于飽和狀態而不能發揮作用所致；而隨著微波功率的增加，得率達到峰值后降低，這可以解釋為較大功率的微波會分解部分單寧。在圖4（b）中顯示了微波處理時間與酶液用量之間的交互關系，隨著微波處理時間的延長，但得率有降低的趨勢，這同樣可認為是由于微波對單寧的分解所致。因此，在本試驗條件下，應該嚴格控制微波的功率與處理時間。

通過響應面分析，得到較優化的工藝參數為：微波功率249 W、酶液用量1.1%、微波處理時間10.04min、酶解時間101.24min，單寧的得率可達6.17%。為了便于試驗控制，將微波功率、酶液用量、微波處理時間、酶解溫度、酶解時間及緩沖液pH值分別設置為250 W、1.1%、10min、60℃、100min和 4.0，進行驗證性試驗，3次平均得率為6.08%，與模型所預測的6.13%很接近，這表明所建立的回歸模型具有較好的預測性。同時進行對比性試驗，其它條件相同，未采用微波處理的單寧得率僅為4.37%，兩者相差1.71%。

2.3 單寧性能分析

2.3.1 紅外光譜分析

將提取的核桃樹葉單寧進行提純，然后進行紅外光譜分析，其紅外譜圖見圖5。

圖5 產物的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of the extraction

由圖5可知，其最能表征單寧特性的紅外光帶為1610cm-1和1517cm-1附近的芳基環振動；在1735cm-1附近有屬于苯基酯C=O伸縮振動；1 445 cm-1為C-H變形和芳基環振動；1 190、1 041 cm-1處為C-H的伸展振動；在835 cm-1附近有吸收峰，說明有苯環的存在；而760 cm-1附近的特征峰表明苯環上有多個取代結構。此外，在3 400 cm-1附近峰形變得寬且強，屬于酚羥基O-H伸縮振動；比對相關文獻[13]發現提取物中含有單寧的主要成分——無色花翠素-3-葡萄糖苷分子結構類物質。

2.3.2 抗氧化能力分析

為了對比分析單寧的抗氧化性能力，將水回流提取法、超聲波提取法及微波輔助纖維素酶法所得到的單寧對·OH、DPPH·和ABTS+·清除的情況進行對比，結果見表4。

表4 不同提取方法的單寧抗氧化能力Table 4 Antioxidant ability of tannin extracted with different method

由表4可知，在本試驗條件下，采用微波輔助纖維素酶法提取單寧的IC50值分別為0.24、0.032 mg/mL和0.43 mg/mL，均遠低于采用水回流提取法及超臨界萃取法所得到樣品的值，這表面其清除自由基的能力強。這可能是因為在水回流和超臨界提取過程中核桃樹葉單寧容易受到長時間加熱、光照等外部條件的影響而發生氧化、異構等變化所致[14]。而微波輔助纖維素酶工藝可使提取溫度降低、提取時間縮短、防止高溫下單寧的氧化，因此不會對單寧分子結構與理化性質有過大的影響，并能保持生物活性。

3 結論

1）采用微波輔助纖維素酶提取核桃樹葉單寧，與單獨使用酶法相比，不僅可以有效的提高單寧得率，而且還能縮短提取時間。

2）選擇酶解溫度和緩沖液pH值分別為60℃和4.0，最佳提取工藝條件為：微波功率250 W、酶液用量1.1%、微波處理時間10min、酶解時間100min。在此工藝條件下，核桃樹葉單寧的得率可達6.08%，比無微波輔助處理的提高了1.71%。

3）微波輔助纖維素酶法所提取的單寧具有較好的活性，對·OH、DPPH·和ABTS+·等自由基的清除能力均高于水回流提取法及超臨界提取法的樣品。

[1]尚俊,馮秀云,王鑫,等.檸檬桉樹皮單寧的提取純化及抗氧化活[J].食品工業科技,2018,39(1):62-69

[2]趙聰.核桃種皮多酚的提純鑒定及抗氧化活性研究[D].天津:天津科技大學,2016:3

[3]鐘雨珅,王歷瓊,韓小丹,等.正交試驗優化超聲波輔助同時提取桑葉總黃酮、單寧工藝[J].食品科學,2015,12(36):44-46

[4]孟明佳,凌敏,張金闖.柿渣中不溶性單寧分析及其抗氧化活性[J].食品科技,2017,42(1):100-103

[5]冀德富,馮凱,張勇,等.粉防己總生物堿的提取與純化研究[J].中華中醫藥雜志,2017,32(12):5656-5658

[6]高瑞苑,張艷,張海容.響應面法優化款冬花綠原酸的微波提取工藝[J].精細化工,2017,34(11):1246-1249

[7]王鶴,慕松,李天聰,等.基于響應面法的枸杞熱風微波聯合間歇干燥工藝探究[J].現代食品科技,2018,34(2):1-8

[8]楊文云,李志國,吳昊,等.絡合法測定塔拉單寧含量的研究[J].西南林學院學報,1999,19(4):249-252

[9]楊瓊瓊.柿木皮單寧提取純化及抗氧化活性研究[D].南寧:廣西大學,2016:5

[10]曾繁濠.恭城月柿單寧提取純化工藝優化及抗氧化活性初步研究[D].湛江:廣東海洋大學,2015:6

[11]陳薈蕓.肉桂單寧提取分離純化及抗氧化活性研究[D].南寧:廣西大學,2014:6

[12]楊丹妮,汪振炯,呂勝男.超聲波協同酶法提取姬松茸基質多糖及其抗腫瘤活性研究[J].食品科技,2017,42(11):212-216

[13]余先純,李湘蘇,龔錚午.石榴皮單寧的超聲波-半仿生法提取及抗氧化性分析[J].化學研究與應用,2013,25(5):636-641

[14]陳美紅.柿單寧抗氧化活性及水解工藝研究[D].武漢:華中農業大學,2009:6