發酵型石榴枸杞酒的工藝優化

李秀秀，吳昊，2，*，白美丹，董晨，李宗磊

（1.徐州工業職業技術學院化學工程技術學院，江蘇徐州221140；2.中國礦業大學化學工程學院，江蘇徐州 221116）

隨著人們物質生活水平的提高，健康成為人們越來越關注的話題，保健酒具有預防疾病，增強人體免疫力等功效，愈來愈受人們的追捧。當前保健酒生產工藝主要有浸泡、勾兌和發酵等方法，其中浸泡、勾兌都不能將原材料中的活性成分充分溶出，因而降低了保健功效，而且酒感差，不易于被消費者接受。

本研究中旨在開發出新型石榴枸杞發酵保健酒，加入的酵母菌能夠充分利用果汁中的糖分生成酒精，并將石榴和枸杞中的營養成分溶出，充分汲取了兩者的活性有效成分，具有美容養顏、抗衰老、增強人體免疫力，預防心血管及腫瘤等保健功效[1-2]。本文重點探討了影響石榴枸杞酒的發酵工藝參數，確定最優工藝條件，為石榴枸杞發酵酒的開發和生產提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

石榴：徐州賈汪；枸杞：寧夏；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：太古糖業有限公司；果膠酶（生化級）：江蘇銳陽生物科技有限公司；二氧化硫（食品級）：法國進口；葡萄糖（標準品）：中國計量科學研究院；沒食子酸（標準品）、蘆?。藴势罚?、綠原酸（標準品）：北京萬佳首化生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

料理機：九陽股份有限公司；DZG-6090真空電熱干燥箱、DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海實驗儀器有限公司；WYT-J手持式糖度計：杭州生物科技有限；酒精計：河北省武強縣同輝儀表廠；FA1204B電子天平、UV1901PCS紫外可見分光光度計：上海儀器儀表有限公司；SHB循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；RV 10旋轉蒸發儀：IKA（廣州）儀器設備有限公司；GL-20B高速冷凍離心機：上?？茖W儀器廠；Essentia LC-15C高效液相色譜：SHIMADZU儀器（蘇州）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 石榴枸杞酒的工藝流程

1.3.2 石榴汁的制作

挑選個大、無損壞的石榴，去掉外皮和內種皮，用清水清洗數次，按照石榴比水1∶1（g/mL）的比例加水，放入料理機進行榨汁[3]。

1.3.3 枸杞汁的制作

挑選個大、果肉肥厚無霉變的枸杞果，用清水清洗數次，按照枸杞比水2.5∶1（g/mL）的比例加水，浸泡3 h，放入料理機進行榨汁[3]。

1.3.4 成分調配

將兩種果汁按照一定比例混合200 mL放入發酵瓶中，用移液管吸取5 mL，在離心機3 600 r/min下離心10min之后，用移液管移取上清液并測量其糖度及酸度，按每17 g/L的糖能產生1%vol酒精調整糖度，本試驗用白砂糖調整糖度，使糖度達到25%，用檸檬酸調pH值在3.1～3.8之間即可[4-5]。

1.3.5 混合原料預處理

將成分調配好的果汁混合液，放入一定量的果膠酶和 SO2，接入活化酵母[6-9]。

1.3.6 發酵工藝單因素試驗

考察石榴枸杞汁比、酵母量、發酵溫度以及發酵時間等4個因素對酒精度的影響，探討單因素的最佳工藝參數。

1.3.7 發酵工藝正交試驗

根據單因素試驗，選擇了石榴枸杞汁比、酵母量、發酵溫度以及發酵時間4個因素3個水平進行正交試驗[10-13]。試驗因素水平見下表1。

表1 發酵工藝正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process

1.3.8 感官評定

發酵結束，挑選了10名有經驗的釀酒師進行品嘗，打分取其平均值。石榴枸杞保健酒的感官評定標準包括酒體、口感、色澤3項，總分100分[14-16]。保健酒的評分依據見表2。

表2 酒的感官評定標準Table 2 Sensory organ criteria for evaluation of health wine

1.3.9綜合評價

發酵酒的質量主要以酒精度和感官評定為評判標準，因此本試驗以酒精度和感官評定各50%的權重為綜合評判。綜合評價=酒精度×50%+感官評定×50%。

1.3.10 后發酵處理

前發酵結束后，將上部清液轉入另一個已滅過菌的發酵瓶中，與酵母及酒腳等沉淀物分離，在16℃～20℃下發酵30 d。

1.3.11 發酵酒多酚類化合物的含量測定

因石榴中含有多種多酚類活性物質，是保健酒中重要的活性成分，因此檢測分析發酵酒中的多酚類化合物含量可作為保健酒質量的評判標準。本試驗選擇沒食子酸為標準品，采用Folin-Ciocalteu比色法進行測定[17-18]。

1.3.12 發酵酒多糖的含量測定

枸杞含有枸杞多糖的活性成分，具有抗氧化作用，增強人體免疫力。因此，對發酵酒中多糖含量的檢測和分析，可作為保健酒質量的評價標準。本試驗選擇以葡萄糖做標準品，用硫酸-苯酚比色法進行測定[19]。

1.3.13 發酵酒黃酮的含量測定

用亞硝酸鈉和硝酸鋁絡合法測定發酵酒中的黃酮含量[20]。

1.3.14 發酵酒綠原酸的含量測定

發酵酒綠原酸含量測定采用高效液相色譜法見文獻[21]。

1.3.15 發酵酒質量指標分析

按GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定酒精度、總糖、總酸和干浸出物含量。按GB 2758-2012《食品安全國家標準發酵酒及其配制酒》測定細菌總數、大腸菌群數以及致病菌數。

2 結果與分析

2.1 石榴枸杞汁比對石榴枸杞發酵酒的影響

取經處理好的石榴枸杞汁，在酵母量4%，發酵溫度26℃，發酵時間6 d的條件下，考察不同石榴枸杞汁比對石榴枸杞發酵酒的影響，見圖1。

圖1 石榴枸杞汁比對石榴枸杞發酵酒的影響Fig.1 Influence of juice ration on pomegranateandmedlar fermentation wine

由圖1可知，當石榴枸杞汁體積比為2∶1時酒精度達到最高，可能是因為此時的石榴枸杞混合汁的滲透壓較適合釀酒酵母的生長，因此酵母代謝產生酒精含量高[22]。當逐漸增加石榴汁的比例時，由于石榴汁相比較枸杞汁來說含糖量較低，因此補加的白砂糖愈多，可能對發酵過程產生消極的影響，當二者體積比超過2∶1時酒精度呈下降趨向，這可能與添加白砂糖可能會影響到酵母的正常生長和代謝有關。因此，選擇石榴枸杞汁體積比2∶1為最佳汁液比。

2.2 酵母量對石榴枸杞發酵酒的影響

取經處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁體積比為2∶1，發酵溫度26℃，發酵時間6 d的條件下，考察不同酵母量對石榴枸杞發酵酒的影響，見圖2。

圖2 酵母量對石榴枸杞發酵酒的影響Fig.2 Influence of yeast addition quantity on pomegranate and medlar fermentation wine

由圖2可知，隨酵母量的增加酒精度增加，糖度則相應的減少，因為酵母量越多，越有利于糖向酒精產物方向轉化，但當酵母量超過3%時，酒精度反而減小，可能是因為酵母量過多，導致微生物繁殖過快而造成底物營養缺乏，微生物產生激烈的競爭，從而影響微生物生長發酵[23]。酵母量超過3%時，由于營養源不足造成發酵酒中的含糖量略微增加，因此選擇酵母接種量為3%時為最佳添加量。

2.3 發酵溫度對石榴枸杞發酵酒的影響

取經處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁體積比為2∶1，酵母量4%，發酵時間6 d的條件下，考察不同發酵溫度對石榴枸杞發酵酒的影響，見圖3。

由圖3可知，隨著發酵溫度的升高酒精度不斷增加，當溫度到達26℃時酒精度達到最大值，糖度為最小值，溫度超過26℃酒精度呈下降趨向，因為溫度對酵母菌的生長繁殖有重要的影響，溫度低于26℃，此時沒有達到酵母菌的最適生長溫度，酵母菌生長繁殖較慢，隨著溫度的升高，酵母菌成長速度逐步加快，26℃時生長繁殖最快，新陳代謝旺盛，產酒精量高。當溫度超過26℃時，此時影響了酵母菌的生產繁殖，代謝降低，酒精度降低，所以選擇溫度26℃為最佳發酵溫度。

圖3 發酵溫度對石榴枸杞發酵酒的影響Fig.3 Influence of temperature on pomegranate and medlar fermentation wine

2.4 發酵時間對石榴枸杞發酵酒的影響

取經處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁體積比為2∶1，酵母量4%，發酵溫度26℃的條件下，考察不同發酵時間對石榴枸杞發酵酒的影響，見圖4。

圖4 發酵時間對石榴枸杞發酵酒的影響Fig.4 Influence of time on pomegranate and medlar fermentation wine

由圖4可知，在發酵3 d～6 d酒精度呈平緩上升，第6天酒精度達到最高，6天之后呈下降趨勢，剛開始隨著發酵時間不斷增加，酵母菌不斷適應新的生長環境，經歷遲滯生長期，糖醇轉化率也在不斷提高，第6天的時候酵母菌的發酵趨于穩定，酒精度為最高，隨后進入后熟階段。在后熟階段，可能有部分糖轉變成其他的小分子代謝產物，所以糖含量呈略微下降趨勢。選擇發酵時間6 d為最佳發酵時間。

2.5 發酵工藝條件優化正交試驗

以發酵酒酒精度為考察指標，正交試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

由表3可知，發酵的最大影響因素是發酵溫度，其次依次是酵母量、石榴枸杞汁比、發酵時間。發酵最佳工藝組合為A2B2C3D2，即石榴枸杞汁體積比為2∶1，酵母量為3%，溫度為28℃，時間為6 d。

由表4可知，對發酵酒的影響差異極顯著的因素是發酵溫度（p＜0.01），差異顯著的是酵母接種量因素（p＜0.05）。在最佳工藝條件下進行3次驗證試驗，酒精度為11.5%，評分達到 94.4，見表5。

表3 發酵工藝條件優化的正交試驗結果及分析Table 3 Analysis and results of orthogonal experiments for fermentation processes optimization

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance of orthogonal experiments results and analysis

表5 最佳發酵工藝試驗結果Table 5 Test results of the optimized fermentation process

2.6 發酵酒活性成分含量檢測

在最優工藝條件下獲得的發酵酒，經陳釀澄清過濾取樣分析，每項測定取3個平行樣進行分析檢測，結果見表6。

表6 石榴枸杞酒活性成分含量檢測結果Table 6 Test results of content of active component on pomegranate and medlar wine

由表6可以看出，發酵酒中含多酚、多糖、黃酮以及綠原酸含量分別為200 mg/L、1.15 g/L、56.14 mg/L、35.15 mg/L，這些有效成分對心血管疾病的防治具有一定的療效[18]。

2.7 發酵酒的質量指標

2.7.1 理化指標

酒度：11.5%Vol；總糖（葡萄糖計）：17.23 g/L；總酸（檸檬酸計）：5.34 g/L；干浸出物：31.32 g/L。

2.7.2 微生物指標

細菌總數≤50cfu/mL；大腸菌群數≤3MPN/100mL；致病菌數=0。

3 結論

根據單因素試驗和正交試驗，得出石榴枸杞的最佳發酵工藝條件即石榴枸杞汁體積比為2∶1，酵母量為3%，溫度為28℃，時間為6 d，由此得到的保健酒香純厚，酒味突出，顏色為棕紅色，有光澤，透明度高，無苦澀味。發酵酒經過陳釀澄清得到成品酒，經檢測，產品符合GB 2758-2012《食品安全國家標準發酵酒及其配制酒》，酒體中含有豐富的活性物質，其中多酚類化合物含量200 mg/L，多糖含量達1.15 g/L，具有防治心血管疾病及增強人體免疫能力等保健功效。

本試驗采用石榴枸杞混合發酵釀制保健酒，充分利用了石榴枸杞的營養價值以及保健作用，對今后保健酒的制備有一定的實踐指導意義。

[1]毛海燕,陳祥貴,陳玲琳,等.石榴果醋釀造工藝研究[J].中國調味品,2013,38(8):88-92

[2]張超,王玉霞,周丹紅.發酵型青梅枸杞果酒澄清技術研究[J].中國釀造,2015,34(12):149-152

[3]楊天英,趙金海.果酒生產技術[M].北京:科學出版社,2009

[4]安冬梅.影響枸杞酒品質的因素及其控制措施[J].中國釀造,2006,25(7):52-54

[5]顧國賢.釀造酒工藝學[M].北京:中國輕工業出版社,1996:399-403

[6]顧慶才.石榴汁澄清問題的研究[J].食品科學,1998,19(11):64-65

[7]馬永全,于新.胡蘿卜、番茄復合果醋釀造工藝的研究[J].中國調味品,2010,35(5):66-68

[8]劉詠,羅建平.枸杞子中食用紅色素的提取及穩定性研究[J].食品科學,2005,26(5):168-170

[9]湯衛華,曹天一,王立暉,等.枸杞酒枸杞酶解條件的研究[J].中國釀造,2014,33(6):103-106

[10]李云雁,胡傳榮.實驗設計與數據處理[M].北京:化學工業出版社,2005

[11]郭曉旭,王強,李國瑩,等.紅曲枸杞酒發酵工藝優化研究[J].釀酒科技,2015(5):79-82

[12]成周霞,李娟,吳昊,等.保健型銀杏枸杞酒的發酵工藝研究[J].釀酒,2016,43(4):71-75

[13]王靜,習素榮,黃亞東,等.黃芪紅景天銀杏發酵型保健酒研究[J].釀酒科技,2015(11):98-101

[14]陸曉濱,趙祥忠,劉慶軍.干酵母發酵生產枸杞酒的研究[J].釀酒,2003,30(1):78-80

[15]周耀明,楊猛.枸杞銀杏保健酒的研發[J].食品研究與開發,2015(11):72-75

[16]李雄,劉爭艷,李新社,等.覆盆子枸杞生態保健酒的研發[J].中國釀造,2013,32(10):146-148

[17]李國秀.石榴多酚類物質的分離鑒定和抗氧化活性研究[D].西安:陜西師范大學,2008

[18]李明月,郝雅蘭,樊明濤,等.石榴酒釀造過程中的多酚及其抗氧化性[J].天津農業科學,2014,20(11):19-23

[19]李良,金文娟.枸杞多糖含量測定方法的比較分析[J].食品研究與開發,2016,37(11):143-146

[20]丁利君,吳振輝,蔡創海,等.金銀花中黃酮類物質最佳提取工藝的研究[J].食品科學,2002,23(2):62-66

[21]劉磊,何再安,余子川,等.高效液相色譜法測定金銀花提取物中綠原酸的含量[J].時珍國醫國藥,2008,19(10):2416-2417

[22]張寶善,田曉菊,陳錦屏,等.石榴發酵酒加工工藝研究[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2008,36(12):172-180

[23]王玲,尚云青,匡鈺,等.自制活性干酵母發酵菠蘿果酒適宜條件探討[J].食品工業科技,2013,34(2):294-298