UV法測定益母草總生物堿含量及其不確定度評價(jià)

鄢星，魏惠珍，，吳柳瑾，張曉男，張丹，肖雄，饒毅，，*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330006；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西南昌330006）

不確定度，依據(jù)ISO/IEC指南給出的定義，指表征合理賦予被測量之值分散性，是對測定結(jié)果準(zhǔn)確性評估的參數(shù)，是一種科學(xué)、合理的質(zhì)量控制方法及驗(yàn)證手段[1－3]。與方法學(xué)驗(yàn)證一樣，是分析學(xué)科的重點(diǎn)和難點(diǎn)，2020年版藥典，擬制增加《藥品檢測結(jié)果的不確定度評定指導(dǎo)原則》的征求意見稿，因此，隨著中國實(shí)驗(yàn)室國家認(rèn)可委員會(huì)和國際標(biāo)準(zhǔn)ISO17025對實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范要求的開展，建立測量不確定度評價(jià)分析方法將成為藥學(xué)分析領(lǐng)域的必要步驟[4-5]。

益母草是唇形科益母草屬植物地上部分及，主治婦女月經(jīng)不調(diào)，胎漏難產(chǎn)，產(chǎn)后血暈等病癥，是治療子宮疾病常見的中藥[6]。生物堿是益母草的主要化學(xué)成分，具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛等藥效活性[7-8]。有文獻(xiàn)研究報(bào)道[9-10]，生物堿含量與益母草的作用功效之間存在正相關(guān)的量效關(guān)系，認(rèn)為總生物堿含量越高，益母草的藥理藥效作用越明顯。因此，準(zhǔn)確測定益母草中的總生物堿的含量，對整體控制益母草藥材質(zhì)量具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

本文采用了紫外分光光度法測定益母草中總生物堿含量，對10批益母草中總生物堿含量測定結(jié)果進(jìn)行不確定度評估，保證分析方法的可行性和合理性，同時(shí)確保了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，為使用紫外分光光度儀測定中藥有效成分含量的不確定度研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

益母草分別采自平邑、四川、廣西、貴州、河南5個(gè)產(chǎn)地10批樣品，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院植物鑒定學(xué)老師張中立檢定為唇形科植物益母草（Herba Leonuri Houtt），樣品信息見表1。

表1 益母草信息Table1 Information on Herba Leonuri

雷氏鹽（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（優(yōu)級純）：西隴化工股份有限公司；無水乙醇、95%乙醇（分析純）：上海振興化工一廠；鹽酸水蘇堿對照品（批號S110214，規(guī)格1 g，含量以98%計(jì)）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Milipore超純水。

UV-2550紫外可見分光光度儀、AUW2200十萬分之一天平：日本島津公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；AB104-N萬分之一天平：梅特勒-托利多公司；Mlli-Q超純水儀：美國Milipore公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取鹽酸水蘇堿對照品30.52 mg，加入0.1 mol/L 的鹽酸溶液定容為50 mL 吸取 2、5、8、10、15 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，加入新配置的2%雷氏鹽溶液（臨用現(xiàn)配）6 mL，用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容，搖勻。置冰浴1 h，干燥濾紙過濾，取續(xù)濾液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取6 mL新配制的2%雷氏鹽溶液至25 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容作為空白溶液。在530 nm測定標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收值（Ai）和空白溶液的吸收值A(chǔ)空白，以y=A空白-Ai值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中總生物堿的濃度x（mg/mL）為橫坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=1.840 1x-0.138 3，r=0.999 2。

1.2.2 供試品溶液的配制

精密稱取益母草藥材粉末（過3號篩）約5.0 g，加入0.1 mol/L的鹽酸溶液100 mL，超聲30min，提取2次，合并濾液，水浴蒸至流浸膏，用0.1 mol/L鹽酸溶液多次洗滌溶解至50 mL容量瓶中，取10 mL供試品溶液，加5 mL 2%雷氏鹽溶液，用0.1%鹽酸溶液定容為25 mL，置冰浴1 h，干燥濾紙過濾，取續(xù)濾液，按照“1.2.1”標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行樣品測定。

2 樣品測定結(jié)果

按照2.2制備供試品溶液，在530 nm處測定樣品溶液的吸收值A(chǔ)s，以空白溶液調(diào)零，將A=A空白-As值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算總生物堿含量，見表2。

表2 10批益母草藥材總生物堿含量測定結(jié)果（n=2）Table 2 Determination of total alkaloid content of 10 batches of Herba Leonuri（n=2）

3 不確定度評價(jià)分析

3.1 不確定度來源分析

依據(jù)上述建立的模型及試驗(yàn)方法可知，總生物堿含量測定的不確定來源主要有以下幾個(gè)方面：1）標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度Urel（i）；2）擬合線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度Urel（Yi）；3）供試品引入的不確定度Urel（s）；4）儀器測定的不確定度Urel（A）；5）樣品重復(fù)測定不確定度Urel（F）。各分量之間關(guān)系結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 各分量不確定度關(guān)系結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure diagram of the relation of the uncertainty of each component

3.2 各分量的不確定度分析

依據(jù)《測量不確定度評定與表示》的指示，對于明確區(qū)間范圍但未給出誤差置信水平的，如標(biāo)準(zhǔn)品純度、天平示值和溫度變化的影響按矩形分布取值k=；JJG196-2006《玻璃量器檢定規(guī)程》[11]給出了移液管、容量瓶等量器的誤差區(qū)間，沒有說明置信水平，參照相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，采用三角分布取值計(jì)算不確定度；對于容量瓶、儀器重復(fù)性測定引入的不確定度，認(rèn)為服從正態(tài)分布，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算不確定度。

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

3.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品稱樣

標(biāo)準(zhǔn)品稱樣引入的不確定度的來源有天平的示值誤差和重復(fù)稱樣的誤差。查閱十萬分之一天平檢定報(bào)告可知，其允許誤差為±0.1 mg，依據(jù)矩形分布取值，則天平示值誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1（mi）=。由于天平檢定報(bào)告證書沒有給出最大允許誤差，通過重復(fù)稱量樣品（n=6），計(jì)算天平重復(fù)測量帶來的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3 mg，服從正態(tài)分布，則天平重復(fù)稱量可達(dá)到的最大標(biāo)準(zhǔn)不確定度。標(biāo)準(zhǔn)品的稱樣量為30.52 mg，綜上可得，標(biāo)準(zhǔn)品稱樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

3.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品在配制過程中用到了的玻璃量具有15 mL單標(biāo)移液管，10 mL分標(biāo)移液管，25、50 mL的容量瓶，均屬A類玻璃量具，其不確定度來源有3個(gè)：玻璃量器的校準(zhǔn)、重復(fù)測量和溫度變化。

根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，10 mL分標(biāo)、15 mL單標(biāo)移液管和25、50 mL容量瓶的允許誤差分別為±0.05、±0.025、±0.03、±0.05 mL，通過對以上玻璃量器的重復(fù)驗(yàn)證（n=6）試驗(yàn)得到的重復(fù)測量帶來的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.08、0.05、0.05、0.07 mL，此外，室溫對定容和量取的體積有影響，其量取和校準(zhǔn)最適溫度在20℃，最大允許溫度誤差為±5℃，水的膨脹系數(shù)為N=2.1×10-4/℃，則標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制過程中各分量不確定度計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制引入的不確定度Table 3 Uncertainty in the introduction of standard solution preparation

續(xù)表3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制引入的不確定度Continue table 3 Uncertainty in the introduction of standard solution preparation

3.2.2 樣品引入的不確定度

3.2.2.1 樣品稱樣

樣品稱樣使用的是萬分之一天平，根據(jù)天平檢定報(bào)告證書可知，允許誤差為±1 mg，按矩形分布取值，則天平示值引入的不確定度0.577 3。由于天平檢定報(bào)告證書沒有給出最大允許誤差，通過重復(fù)稱量樣品（n=6），計(jì)算天平重復(fù)測量帶來的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5 mg，服從正態(tài)分布，則天平重復(fù)測量引入的不確定度。

綜上，供試品稱樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（ms）=，15批供試品的平均稱樣量ms為5 004.1 mg，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.000 2。

3.2.2.2 樣品溶液配制

供試品在配制過程中用到的玻璃量具有10、100 mL單標(biāo)移液管和25、50 mL容量瓶，均屬A級玻璃量具，根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，其中10、100 mL單標(biāo)移液管的允許誤差分別為±0.02、±0.08 mL，重復(fù)測量帶來的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.05、0.11 mL，其他同“3.2.1.2”。供試品溶液配制的各分量不確定度計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 供試品溶液配制引入的不確定度Table 4 Uncertainty in the introduction of the preparation of the sample solution

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

本試驗(yàn)配制5個(gè)不同溶度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度由低到高）：0.120 1、0.295 0、0.449 9、0.774 8、1.039 9 mg/mL，每個(gè)濃度的平均吸光值分別為0.1358、0.2411、0.317 8、0.502 8、0.635 0（每個(gè)濃度測 2 次），根據(jù)賽貝爾公式，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的標(biāo)準(zhǔn)偏差Si，則由擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求得供試品Cs引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（Yi）和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（Yi）計(jì)算如下：

式中：j標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定順序（濃度由高到低j=1，2…n）；Aij為對應(yīng)順序 j標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光值；Cij為對應(yīng)順序的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度；x為標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)（x=1.840 1）；z為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距（z=－0.138 3）；s為10批供試品溶液的平均濃度（由表2可計(jì)算出s=0.56 mg/mL）；m為供試品溶液測定的次數(shù)（10批樣品，每批平行測定2次，m=20）；Pn為標(biāo)準(zhǔn)品溶液測定的次數(shù)，（Pn=10）；1為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均濃度（1=0.54mg/g）；為10批樣品的平均含量（由表2可計(jì)算出13.86 mg/g）。

3.2.4 儀器引入的不確定度

主要由儀器本身誤差和儀器重現(xiàn)性測定兩個(gè)方面引入的不確定度。該紫外分光光度儀的檢定報(bào)告證書指出了測量結(jié)果的準(zhǔn)確性誤差為±0.002，按矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度。對10份樣品測定吸光值，求得10份樣品平均濃度為0.236 1 mg/mL，根據(jù)賽貝爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.019 5。假設(shè)服從正態(tài)分布，儀器重現(xiàn)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。則儀器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.5 樣品重復(fù)測定引入的不確定度

根據(jù)“2.4.3”同一份樣重復(fù)測定，6 次測得的含量分 別 為6.078 4、5.891 3、5.789 6、6.000 7、5.865 5、5.936 3 mg/g，平均結(jié)果為5.926 9 mg/g，根據(jù)賽貝爾公式計(jì)算含量測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差SF=0.009 87，服從正態(tài)分布考慮，樣品重復(fù)測定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.3 合成、擴(kuò)展與報(bào)告不確定度的計(jì)算

由已計(jì)算出各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度可由各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按下式合成：。

由此得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 U（CX）=Urel×CX[CX為每批樣品中總生物堿平均含量，（mg/g），見表2；X為每批樣品的編號]；不確定度貢獻(xiàn)率計(jì)算公式為M/%=[urel（W）]2/[Urel]2×100（W為表5中各個(gè)不確定度分量）。各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度及貢獻(xiàn)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。取置信水平為95%，包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度為U（X）=U（CX）×k，由“2.5”試驗(yàn)結(jié)果可知，10 批益母草中總生物堿含量在 19.09 mg/g～2.47 mg/g，報(bào)告不確定度表示為CX±U（X），結(jié)果見表6。

表5 各分量不確定度計(jì)算結(jié)果及貢獻(xiàn)率Table 5 Calculation results and contribution rate of each component uncertainty

4 討論與小結(jié)

雷氏鹽在酸性介質(zhì)中可與絕大部分生物堿反應(yīng)，定量的生成不溶于水的雷氏銨鹽沉淀[14]，常規(guī)測定方法是將沉淀溶解于丙酮中，直接測定溶液的紫外吸光度，根據(jù)Beer-Lambert公式計(jì)算含量。由于沉淀的溶解較為繁瑣，丙酮溶劑本身對人體有害，故本試驗(yàn)在常規(guī)方法上進(jìn)行改進(jìn)，通過測定濾液中剩余雷氏鹽的吸光度[15]，以空白溶液吸光度減去濾液的吸光度，間接測得生物堿含量，改進(jìn)后的方法操作簡單，重現(xiàn)性好。

表6 總生物堿合成不確定度、擴(kuò)展不確定度與報(bào)告不確定度計(jì)算結(jié)果Table 6 Calculation results of total alkaloids of synthetic uncertainty，expansion uncertainty and report uncertainty mg/g

本試驗(yàn)運(yùn)用不確定度理論對紫外分光光度法測定益母草總生物堿含量過程進(jìn)行評定研究，從表5各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算結(jié)果可知，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品重復(fù)測定是不確定度的主要來源，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的合成貢獻(xiàn)度最大為62.63%，說明本方法測定結(jié)果的不確定度主要由擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的，由擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線不確定度計(jì)算過程可知，可能是標(biāo)曲建立選取的濃度點(diǎn)過少，以及檢測樣品的含量差異過大引起的，建議標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的濃度點(diǎn)增加至5個(gè)以上，拉大線性范圍，使所有濃度的樣品在線性范圍之內(nèi)；其次是樣品重復(fù)測定帶來的不確定度，貢獻(xiàn)度為15.43%，在實(shí)際檢測樣品應(yīng)嚴(yán)格樣品制樣引入的不確定度，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，減少人為因素對樣品重復(fù)測定過程中的影響。同時(shí)，為了簡化分析過程，本試驗(yàn)忽略了提取過程中超聲儀和沉淀顯色劑雷氏鹽帶來的不確定度影響。

目前，有關(guān)紫外分光光度法對中藥中有效成分定量測定方法的不確定度分析較少，2015版《中國藥典》規(guī)定了對所建立的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，但未對試驗(yàn)具體結(jié)果作定量的置信性分析，本文以益母草總生物堿含量測定為例，建立紫外光光度法測定中藥中有效成分的質(zhì)量控制方法，并對該方法在試驗(yàn)過程中給測定結(jié)果帶來的不確定度進(jìn)行了定量分析，保障了測定方法的可行性、合理性和試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、有效性，降低了該方法在日常應(yīng)用中的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)為其他分析方法測定中藥有效成分的不確定度定量評價(jià)提供參考。

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