基于功能磁性材料的細菌富集與鑒別

黃艷玲，張澤生，閆爽

（1.天津科技大學，天津300457；2.天津現代職業技術學院，天津300350；3.天津廣播電視大學，天津300350）

面對當前嚴峻的食品安全問題，食源性致病菌的快速分析與鑒別已經成為多學科研究的熱點[1]。由于傳統微生物分析的耗時費力的不足，許多新技術已經應用到微生物的分析與鑒別。首先，基于質譜技術分析方法使微生物快速分析成為可能，特別是基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS），其使用方法簡單、快速、精確和低成本，現已成為微生物分類鑒別的重要工具[2]。當前，利用MALDI-TOF MS分析微生物主要有兩種方法分別是數據庫法與生物信息學法[3]。數據庫鑒別法就是把待檢測微生物與數據庫中標準菌質譜圖進行比對，滿足閾值后來確定待測菌的種屬[4]。生物信息學法就是利用標準蛋白數據庫對微生物蛋白標志物進行比對，從而對微生物進行分類鑒別。該方法中利用完整核糖體蛋白標志物鑒別微生物已被廣泛報道。Tanigawa[5]利用核糖體蛋白通過搜索核糖體蛋白鑒別數據庫對25個乳酸乳球菌菌株進行鑒別。

另外，為了提高MALDI-TOF MS檢測效率，功能性納米材料已經被廣泛應用于微生物的富集與鑒別，功能性納米材料的富集可提高質譜檢測的檢測限與檢測效率。這些納米材料主要是通過在納米Fe3O4微粒表面固定靶向作用分析對微生物進行選擇性富集，主要包括抗體[6-8]、核酸適配體[9]、生物蛋白[10]、糖類物質[11]。從而促進微生物的分離鑒別。由于大腸桿菌O157：H7是一株重要的食源性致病菌，本文通過開發一種簡單、成本低的NH2-Fe3O4磁性顆粒，對大腸桿菌O157：H7進行快速富集，然后利用MALDI-TOF MS對其進行快速檢測，再利用核糖體蛋白庫對大腸桿菌O157：H7進行鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FeCl·36H2O、FeSO·47H2O、Na2HPO·412H2O、NaH2PO·42H2O、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲苯、氨水：天津市光復精細化工研究所；四乙氧基硅烷（TEOS）、γ-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）：武漢大學有機硅新材料股份有限公司；TSB培養基和瓊脂粉：北京奧博星生物制品有限公司；α-腈基-4-羥基苯丙烯酸（CHCA）：Bruker Daltonics；三氟乙酸（TFA：色譜純）：J.T.Baker；乙腈（ACN：色譜純）：J.T.Baker。

超聲清洗器：寧波新芝生物公司；MALDI TOF MS/MS：spectrometer，Autoflex III Bruker Daltonics；Milli-Q水純化系統：Millipore，Milford，MA；振蕩培養箱：上海博迅實業有限公司；磁性分離器：DYNAL?invitrogen；紫外－可見吸收分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope S4800 SEM）：日立（中國）有限公司；LDJ 9600-1振動樣品磁強度計：深圳市泰立儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NH2-Fe3O4磁性顆粒的合成

NH2-Fe3O4磁性顆粒的合成按照Fan[12]報道的方法。

1.2.2 NH2-Fe3O4磁性顆粒的表征

掃描電鏡圖像（SEM）表征NH2-Fe3O4磁性顆粒形貌特征。紅外光譜譜圖的采集是通過傅里葉變換紅外光譜儀采用壓片法對NH2-Fe3O4磁性顆粒的官能團進行分析。NH2-Fe3O4磁性顆粒的磁性是在室溫條件下通過LDJ 9600-1振動樣品磁強度計對材料的磁性進行表征。

1.2.3 大腸桿菌O157：H7的富集

在37℃下，大腸桿菌O157：H7接種于25 mL滅菌TSB培養基中，搖床120 r/min培養16 h后，1 mL細菌菌懸液離心（12 000 r/min）5min，倒出上清，并用磷酸鹽（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液清洗兩次，然后，利用紫外-可見吸收分光光度計600 nm波長調整到所需的濃度，另外，利用活菌計數法對其進行計數。

用PBS緩沖液配制NH2-Fe3O4磁性顆粒懸濁液（10 mg/mL），不同體積NH2-Fe3O4磁性顆粒懸濁液加入到菌液中，渦旋振蕩，然后磁性分離，并用紫外－可見吸收分光光度計600 nm波長測量溶液OD值。

1.2.4 大腸桿菌O157：H7分析與鑒別

NH2-Fe3O4磁性顆粒吸附完畢，倒出上清后，加入50 μL氨水，在超聲清洗器中振蕩3min，磁性分離，去除NH2-Fe3O4磁性顆粒，上清12 000 r/min離心，然后分別加入10 μL 0.1%TFA與ACN后，渦旋振蕩，取1 μL溶液用于MALDI MS線性模式進行分析。

利用 Flexanalysis軟件 （version 3.0；Bruker Dal tonics）對質譜數據進行基線校正、平滑和標峰。然后利用 Tagident搜索工具（http：//web.expasy.org/tagident/）對質譜峰進行數據庫檢索 （UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL）確定蛋白。然后，利用得到的核糖體蛋白搜索微生物快速鑒別數據庫（rapid microorganism identification database；http：//rmidb.org）確定大腸桿菌歸屬。

1.3 模擬實際樣本大腸桿菌O157：H7分析與鑒別

從超市中購買的碳酸飲料，加入活菌計數完畢的不同濃度的大腸桿菌O157：H7的菌懸液，然后利用NH2-Fe3O4磁性顆粒富集，MALDI MS檢測，并利用數據庫進行菌株鑒別。

2 結果與分析

2.1 NH2-Fe3O4磁性顆粒表征

NH2-Fe3O4磁性顆粒合成完畢后，分別利用掃描電鏡、磁滯回線與紅外光譜對磁性顆粒的形貌、磁性能力與官能團進行分析見圖1。從電鏡圖上可以看出（圖1），NH2-Fe3O4磁性顆粒成球形，其直徑800 nm左右，其粒徑較大，為了便于超聲從菌體表面去除，以利于菌體檢測。另外，在磁滯回線圖上（圖2），其磁化值分別為50emu/g，這非常便于磁球從溶液中分離。同時，從紅外譜圖上（圖3），可以看到在620 cm-1和453 cm-1吸收峰對應為Fe-O鍵的振動吸收和1 630 cm-1處NH的彎曲振動，由紅外光譜圖可知，NH2-Fe3O4磁性顆粒被成功合成。

圖1 NH2-Fe3O4顆粒掃描電鏡Fig.1 Scanning electron microscopy of NH2-Fe3O4particles

圖2 NH2-Fe3O4顆粒磁滯回線Fig.2 Hysteresis loop of NH2-Fe3O4particles

圖3 NH2-Fe3O4顆粒紅外譜圖Fig.3 Infrared spectrum of NH2-Fe3O4particles

2.2 NH2-Fe3O4磁性顆粒對大腸桿菌O157：H7的富集

圖4 NH2-Fe3O4磁性顆粒富集的優化Fig.4 Enrichment optimization of NH2-Fe3O4magnetic particle

由于細菌PBS緩沖液條件下帶負電荷，而NH2-Fe3O4磁性顆粒的等電點為3，而使磁球帶正電荷，因此磁球會很快吸附到菌體表面，在外加磁場的作用下，菌體會脫離水溶液，而得到富集。磁球富集條件的優化見圖4。

從圖4可以看出，當富集時間到達70 s時，菌體幾乎100%得到富集。而磁球濃度為0.5 mg/mL時，磁球富集的效果最佳。因此，利用NH2-Fe3O4磁性顆粒富集大腸桿菌簡單、快速，而且合成的成本很低。

2.3 MALDI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7的檢測限

通過NH2-Fe3O4磁性顆粒富集，使MALDI/TOF MS對低濃度細菌進行檢測，不同細菌濃度的質譜圖見圖5，NH2-Fe3O4磁性顆粒富集效果的對比見圖6。

圖5 不同細菌濃度的質譜圖Fig.5 Mass spectra of different bacterial concentrations

圖6 NH2-Fe3O4磁性顆粒富集效果的對比Fig.6 Comparison of enrichment effects of NH2-Fe3O4magnetic particles

從圖5可以看出，通過對大腸桿菌O157：H7一系列的稀釋，富集后，當細菌濃度為3.5×102CFU/mL時（圖5A），幾乎沒有質譜信號，而當細菌濃度達到3.5×103CFU/mL時（圖5B），有清晰的質譜信號，而主要的質譜峰與細菌濃度在3.5×104CFU/mL時幾乎無異（圖5C），同時這些質譜的信噪比超過5，因此MALDI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7的檢測限達到3.5×103CFU/mL。

另外，通過對比未富集的大腸桿菌O157：H7的質譜圖可以看出（圖6），在細菌濃度為3.5×104CFU/mL時，未富集的質譜在大于5 000 m/z以上，未有質譜峰出現，而富集后，質譜峰數量大大增加，因此，通過NH2-Fe3O4磁性顆粒的富集，可以大大提高MALDI/TOF MS的檢測能力。

2.4 模擬實際樣本中大腸桿菌MALDI/TOF MS檢測與鑒別

本文采用的模擬實際樣本為超市購買的碳酸飲料，通過添加不同濃度的大腸桿菌O157：H7，然后利用NH2-Fe3O4磁性顆粒富集及MALDI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7進行檢測，由于實際樣本中成分比較復雜，飲料中的陽離子會壓制質譜信號，通過一系列不同菌濃的檢測，發現細菌濃度在8×103CFU/mL得到的譜圖可以用于菌株的鑒別，細菌濃度在8×103CFU/mL，MAL DI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7的質譜圖見圖7。

圖7 MALDI/TOF MS對實際樣本中大腸桿菌O157：H7檢測Fig.7 Detection of Escherichia coli O157：H7 in real samples using MALDI/TOF MS

為了利用質譜對大腸桿菌O157：H7進行鑒別，對質譜圖進行處理包括基線校正、平滑，選取信噪比大于5的14個質譜峰作為菌株鑒別的依據，這些質譜峰通過搜索UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL的蛋白數據庫，最終確定14個質譜峰蛋白歸屬，每個質譜峰的蛋白搜索結果見表1。

表1 大腸桿菌O157：H7蛋白Swiss-Prot/TrEMBL數據庫搜索結果Table 1 Search results of Escherichia coli O157：H7 protein in Swiss-Prot/TrEMBL database

這其中共有4個核糖體蛋白被發現，分別是核糖體大亞基的L32、L33、L34、L36 4種蛋白，由于核糖體蛋白具有保守性，通過輸入4種核糖體蛋白的質譜峰，搜索核糖體蛋白數據庫可以對菌株進行鑒別，其鑒別結果為大腸桿菌O157：H7。

3 結論

本文合成了NH2-Fe3O4磁性顆粒，并利用掃描電鏡、磁滯回線和紅外光譜對其進行表征，表征結果證明NH2-Fe3O4磁性顆粒被成功合成，并具有很強的磁性。然后優化了NH2-Fe3O4磁性顆粒富集大腸桿菌O157：H7富集條件。并通過富集，得到MALDI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7的檢測限為3.5×103CFU/mL。最后，通過模擬實際樣本對該方法進行驗證，發現該方法對碳酸飲料中的大腸桿菌O157：H7的檢測限為8.0×104CFU/mL，并利用蛋白數據庫通過4種核糖體蛋白的搜索，證明該菌為大腸桿菌O157：H7。因此，試驗數據證明該方法簡單、快速、成本低，可以用于細菌的分析鑒別。

[1]Hotta Y,Sato J,Sato H,et al.Classification of the genus Bacillus based on MALDI-TOF MS analysis of ribosomal proteins coded in S10 and spc operons[J].Journal of agricultural and food chemistry,2011,59(10):5222-5230

[2]Rezzonico F,Vogel G,Duffy B,et al.Application of whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for rapid identification and clustering analysis of Pantoea species[J].Applied and environmental microbiology,2010,76(13):4497-4509

[3]Sandrin T R,Goldstein J E,Schumaker S.MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level:a review[J].Mass spectrometry reviews,2013,32(3):188-217

[4]Arnold R J,Reilly J P.Fingerprint matching of E.coli strains with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of whole cells using a modified correlation approach[J].RapidCommunicationsinMassSpectrometry,1998,12(10):630-636

[5]Tanigawa K,Kawabata H,Watanabe K.Identification and typing of Lactococcus lactis by matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry[J].Applied and environmental microbiology,2010,76(12):4055-4062

[6]Zhao X-J,Hilliard L R,Tan W-H,et al.A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles[J].Proc.Natl.Acad.Sci.U S A,2004,101:15027-15032

[7]Ryan S,Kell A J,Tanha J,et al.Single-domain antibody-nanoparticles:promising architectures for increased staphylococcus aureus detection specificity and sensitivity[J].Bioconjugate Chem,2009,20:1966-1974

[8]HoK-C,Tsai P-J,Lin Y-S,et al.Using biofunctionalized nanoparticles to probe pathogenic bacteria[J].Anal Chem,2004,76:7162-7168

[9]Torres-ChavollaE,Alocilja E C.Aptasensors for detection of microbialandviralpathogens[J].BiosensBioelectron,2009,24:3175-3182

[10]Liu J-C,Tsai P-J,LeeY C,et al.Affinity capture of uropathogenic escherichia coli using pigeon ovalbumin-bound Fe3O4@Al2O3magnetic nanoparticles[J].Anal Chem,2008,80:5425-5432

[11]El-Boubbou K,Gruden C,Huang X-F.Magnetic glyco-nanoparticles:a unique tool for rapid pathogen detection,decontamination,andstraindifferentiation[J].JAmChemSoc,2007,129:13392-13393

[12]Fan G,Ren Y,Jiang W,et al.Effective catalytic hydrodechlorination of 4-chlorophenol over a Rh immobilized on amine-functionalized magnetite nanoparticles in aqueous phase[J].Catalysis Communications,2014,52:22-25