β-半乳糖苷酶的研究現狀與進展

董藝凝， 陳海琴， 張 灝， 陳 衛

（1.滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）全稱為 β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶 （β-D-galactoside galacto hydrolase，EC3.2.1.23），具有催化乳糖水解和轉糖苷兩種功能[1]。特別是利用其轉糖苷作用合成低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharides，GOS），已逐漸成為近年來功能性低聚糖開發與技術應用的新熱點[2]。與其他人們較為熟知的功能性低聚糖，如低聚果糖（Fructo-oligosaccharide，FOS）和低聚異麥芽糖（Isomatto-oligosaccharide，IMO）等相比，低聚半乳糖是唯一能夠被人體全部腸道益生菌利用的真正益生元。特別是母乳中所含低聚半乳糖（Human milk oligosaccharides，HMO）是形成嬰兒初期腸道益生菌類型的關鍵因子。由于母乳來源的低聚半乳糖（HMO）結構復雜且數量有限，因此通過酶法合成GOS已成為HMO的主要替代品。目前的全球消費量在20 000 t/年左右，并以每年10%～20%的比例增長[3]。

但是，β-半乳糖苷酶普遍轉糖苷活性低，并且由于底物水解反應的同時存在，導致產物往往包括多樣化糖苷聚合度及糖苷鍵構成類型，并最終限制了GOS合成量和純度。我國對β-半乳糖苷酶催化合成GOS的研究起步相對較晚，目前生產中所需β-半乳糖苷酶的來源仍以進口為主[4-5]。自2008年批準GOS作為新資源食品以來，國內具有產業化生產規模的僅限于少數幾家企業，如廣東江門量子高科生物工程有限公司與廣東云浮市新金山生物科技有限公司。而高純度GOS產品的生產在我國還處于空白階段。如何改造并調控β-半乳糖苷酶的催化反應以解決GOS合成產量及及優化產物分子結構是目前β-半乳糖苷酶功能開發與應用的共性技術問題。

針對行業技術發展現狀，只有對β-半乳糖苷酶催化機理及產物形成機制開展深入的研究探索，才能有望從反應調控與功能優化角度有效解決GOS產業發展的關鍵技術問題。作者針對近十年相關研究過程中所積累下的大量酶學、結構學及生物信息學數據成果，從β-半乳糖苷酶的分類、催化機制理論、結構及特殊催化功能開發幾個方面對β-半乳糖苷酶的理論與應用研究現狀與進展進行綜述，以期為β-半乳糖苷酶催化機理的深入研究與功能調控提供參考。

1 β-半乳糖苷酶家族分化及催化機制形成

酶的分子改造與功能開發需要有深入的催化機理研究和豐富的基因進化信息作為基礎。1991年，Henrissat第一次根據氨基酸序列相似性對糖苷水解酶進行分類[6]，到目前為止，已由最初的35個家族發展成135個，分屬于14個（GH-A～GH-N）糖苷水解酶超家族 （http：//www.cazy.org/）。基于氨基酸序列相似性進行分類的方法可以使不同底物特異性的糖苷水解酶聚類為同一家族，如GH-1，GH-13，GH-16家族都含有不同底物特異性的成員。同樣，具有相同底物特異性的糖苷水解酶也可能分屬于不同的家族，如纖維素酶就分屬于11個不同的家族。但對于β-半乳糖苷酶的家族分布及其催化機制的形成特點目前尚無系統的分析與總結。

1.1 β-半乳糖苷酶家族分化

β-半乳糖苷酶可以水解β-1，4-糖苷鍵，屬糖苷水解酶類（Glycoside Hydrolases，GH），并在進化過程中演變形成多樣的底物特異性。依據蛋白質序列相似分類，β-半乳糖苷酶分別屬于糖苷水解酶家族GH-1，GH-2，GH-35和 GH-42， 并在這些家族分布中顯現出不同的催化及結構特征。如，GH-1，GH-2和GH-35家族除了β-半乳糖苷酶還包括其它糖苷水解酶類，只有GH-42家族所有成員都為β-半乳糖苷酶，而GH-2家族的β-半乳糖苷酶通常在糖苷水解和轉糖苷兩方面都表現出較高的活性。 還有研究表明，GH-1，GH-2，GH-5，GH-10，GH-17，GH-30，GH-35，GH-39 以及 GH-42 家族是由共同的祖先分子進化而來[7-8]。雖然，不同家族的糖苷水解酶的數量、酶學特征差別很大，但其催化構象及機制在進化過程中是卻是嚴格保守的。

1.2 β-半乳糖苷酶的催化機制研究

糖苷水解酶有兩種經典的催化機制由Koshland在多年前提出并一直沿用至今，包括保持型（Retaining）機制和反轉型（Inverting）機制。這一理論主要基于糖苷水解酶在催化過程中會出現兩種不同的立體化學產物，即產物的異頭碳構象與供體底物的相同或不同。保持型糖苷水解酶遵循兩步反應的雙替換機制 （two-step double-displacement mechanism），包括糖基-酶復合物過渡態的形成和水解，每步反應均通過酸堿催化完成（如圖1（a））。這個過程需要兩個含羧基的關鍵氨基酸參與，一個作為親核基團攻擊底物異頭碳形成糖基-酶復合物；另一個羧基基團作為酸堿催化劑，在第一步反應中使羰基氧質子化，第二步反應中催化脫去一分子水。反轉型糖苷水解酶采用的是直接替換機制，活性位點為兩個含羧基氨基酸。一個羧基作為堿性基團攻擊水分子，另一個羧基通過廣義的酸催化斷裂糖苷鍵。催化反應通過一個類似氧代碳正離子過渡態實現（如圖1（b））。作為質子供體的羧基氨基酸位置在兩種催化機制中保持一致，均位于能夠與糖苷氫鍵結合的距離范圍內。但兩種催化機制堿性催化基團的位置有所差別，其中保持型糖苷水解酶堿性基團與糖基異頭碳的位置非常接近；而反轉型催化機制中，因必須容納一個水分子在堿性基團與糖基之間，使這一距離增大。這種差別造成兩種機制中關鍵催化殘基間距的不同，保持型催化機制兩個催化殘基距離約為5.5×10-10m，反轉型催化機制中兩者距離約為 9.5×10-10m[10]。

圖1 糖苷水解酶催化機制Fig.1 Glycosidases mechanisms

糖苷水解酶家族的結構特征并不直接決定酶的立體化學催化特性，很多超家族中都同時具有保持型和反轉型糖基水解酶。但同一家族的水解酶往往具有相同的催化機制。目前，普遍認為β-半乳糖苷酶采用的是保持型水解機制。催化過程如圖2所示。首先，底物分子需要與酶分子對接。當底物是乳糖時，糖基部分為半乳糖基，配糖體為葡糖基（如圖2中R1所代表）。β-半乳糖苷酶具有高度底物專一性，要求底物的半乳糖基必須與多糖部分以β-糖苷鍵連接。但對糖苷配基的要求不是很嚴格，因此R1所表示的配糖體部分甚至可以是低聚糖，此時反應得到的產物即為低聚半乳糖（GOS）。早期研究表明β-半乳糖苷酶的結構特征對底物與酶的活性位點結合非常重要，研究報道主要集中在氫鍵、離子鍵及芳香族氨基酸側鏈對底物結合的影響等方面[11-12]。近年來研究發現，酶與底物結合模式，特別是結合位點氨基酸的類型與側鏈性質對催化活性影響顯著[13-15]。其次，當底物對接到酶活性位點后，即與酶分子以共價鍵結合。隨即半乳糖基再被轉移到親核受體上。在這步反應中，反應會根據受體的不同而發生分歧。當半乳糖基受體為水分子 （即圖中R2=H），反應釋放出半乳糖。在此情況下，乳糖或低聚糖所發生的就是水解反應，二糖或多糖被降解；當受體為另一個多糖時，反應就會朝向低聚半乳糖（GOS）合成的方向進行，這種情況下發生的就是轉糖苷反應。目前所有關于轉糖苷機制的研究報道，都是基于對糖苷水解反應做出的推測。尚不清楚當受體不同時（比如糖類或水），β-半乳糖苷酶的水解活性是否發生改變。但是，不同β-半乳糖苷酶對水和糖類的選擇特異性有差別，即使催化作用相同，不同酶的催化能力及產物 （水解及轉糖苷產物）組成均不相同[16-17]。也有研究表明，β-半乳糖苷酶的底物特異性與活性位點氨基酸模塊（motif）有關[18]。

2 微生物來源β-半乳糖苷酶的催化特性及研究概況

許多生物自身可以合成β-半乳糖苷酶，包括微生物、植物及動物細胞[2]。這些不同來源的β-半乳糖苷酶在酶學特征上存在較大差異，只有對其酶學特性有所認識和比較，才能更好的開發適合工業應用的生物催化劑。通過家族間β-半乳糖苷酶來源的比較分析發現，微生物來源β-半乳糖苷酶的數量最為豐富。因此，作者總結并分析了主要微生物來源β-半乳糖苷酶的催化特性及其在基因工程方面的研究進展。

圖2 β-半乳糖苷酶反應機制[11]Fig.2 Reaction mechanism for β-galactosidase

2.1 β-半乳糖苷酶的微生物來源

目前，被廣泛應用于工業生產的是來自霉菌（Aspergillus spp.）和克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces spp.）的β-半乳糖苷酶。這兩種微生物可以較容易的通過培養獲得可觀的生產能力及產量。且霉菌和乳酸克魯維酵母來源產物被公認為具有食品安全性（GRAS），這一點對食品消費至關重要[19]。霉菌屬來源β-半乳糖苷酶是胞外酶，最適pH在酸性范圍內（2.5～5.4），最適作用溫度最高可達50℃，主要被應用于水解酸性pH條件的乳清[20]。相反，克魯維酵母菌屬來源β-半乳糖苷酶是胞內酶，乳糖需要先通過透性酶轉運進入酵母細胞內再被水解代謝[21]。酵母來源的β-半乳糖苷酶最適作用pH接近中性（6.0～7.0），因而有比較廣泛的應用，尤其用于牛乳及乳清中乳糖的水解。商業化β-半乳糖苷酶主要包括乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）和馬克斯克魯維酵母 （Kluyveromyces marxiamus）（根據目前的分類還包括 Kluyveromycesfragilis和Saccharomycesfragilis及其變形體 Candida pseudotropicalis）； 霉菌屬有黑曲霉（Aspergillus niger）和米曲霉（Aspergillus oryzae）。另外，大腸桿菌（Escherichia coli）來源β-半乳糖苷酶作為模式酶，研究最為廣泛并被商業化生產，但因其不屬于食品安全級產物（GRAS），而被主要用于生化分析領域。除此之外，已實現商業化上產的還有桿菌屬（Bacillus sp.）來源的 β-半乳糖苷酶。

2.2 β-半乳糖苷酶的基因工程研究現狀

除了在自然界不斷發掘具有新特性的酶，對于一些在來源微生物中表達量較低的β-半乳糖苷酶，可以通過DNA重組技術對其進行外源表達以提高產量，從而擴展其應用范圍及在工業生產中的經濟利用價值。同時，現代分子生物技術結合生物工程策略對酶的生產優化與功能改造，形成了具有經濟、技術效益的酶生產體系。目前，針對β-半乳糖苷酶的生物工程改造主要包括酶的重組表達、轉糖苷活性調控、胞外分泌改造及底物抑制作用優化等幾個方面[22-25]。近年來，快速發展的晶體結構研究與數據積累也為β-半乳糖苷酶的功能改造奠定了基礎。作者將微生物來源的β-半乳糖苷酶晶體結構數據匯總如表1。截止2000年，β-半乳糖苷還僅有8個酶晶體結構報道[26]。但時間發展到2010-2015期間，研究報道迅速累積到103例道。目前，β-半乳糖苷酶的晶體結構已經達到190個，但用于食品工業生產中的β-半乳糖苷酶還沒有結構數據的研究報道。相對于快速開發的食品用β-半乳糖苷酶，其結構機制方面的研究明顯不足。

表1 β-半乳糖苷酶晶體結構在蛋白質數據庫中的收錄匯總Table 1 β-Galactosidases with crystalstructures deposited in the Protein Data Bank

3 耐熱β-半乳糖苷酶的應用優勢

β-半乳糖苷酶雖然已經實現商品化，但是其應用仍受到熱穩定及產物抑制等問題的限制。因此，開發不同來源、具有特殊催化功能的β-半乳糖苷酶一直是工業化生產的一項需求。目前β-半乳糖苷酶開發的主要方向包括：一是酵母和細菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶及具有低溫活性的酶；二是乳酸菌（包括 lactococci，streptococci和 lactobacilli） 及雙歧桿菌等被認定為食用安全微生物來源的食品級β-半乳糖苷酶，以應用于功能性食品的開發。特別是耐熱β-半乳糖苷酶一直在乳品生產領域備受關注。由于高溫反應條件具有獨特的生產應用優勢，包括提高底物溶解度，獲得較高的乳糖初濃度；降低水解產物對酶活的抑制作用；增大反應速率；進而延長生產過程中酶的半衰期；降低微生物污染的風險等。因此，相對于常溫及低溫β-半乳糖苷酶，耐熱β-半乳糖苷酶具有更強的適應性。

目前，以嗜熱原核微生物及其耐熱酶的研究最為系統。有關耐熱β-半乳糖苷酶的來源及性質已有大量研究報道[20，27-29]。耐熱β-半乳糖苷酶多來源硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus）和激烈火球菌（Pyrococcus furiosus），以及一些高溫菌和中溫細菌，如耐熱嫌氣菌、棲熱菌、嗜熱菌和古細菌等。其中，嗜熱細菌是耐熱β-半乳糖苷酶的一個重要來源，嗜熱細菌生長溫度一般在55～65℃，酶最適溫度55～70℃。如嗜熱鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等[30]。表2列舉了幾種不同微生物來源的耐熱β-半乳糖苷酶及酶學性質。另外，真菌中霉菌乳糖酶也具有較高作用溫度，但酵母菌來源耐熱酶尚未見報道。通過對不同微生物來源的β-半乳糖苷酶進行比較，可以發現耐熱β-半乳糖苷酶在不同的溫度、pH及化學條件下均表現出較高的穩定性[30-31]。

表2 不同微生物來源耐熱β-半乳糖苷酶的酶學性質Table 2 Enzyme properties of thermostable β-galactosidase from different microorganisms

4 展 望

作為重要的糖苷水解酶，針對β-半乳糖苷酶的研究多年來集中于兩個領域，一是新酶源的開發[32]；二是β-半乳糖苷酶催化活性的分子調控[33-35]。圍繞這兩個研究方向，作者重點綜述和分析了3個相關問題，包括β-半乳糖苷酶的家族分化及催化理論形成、酶源的開發與應用、特殊酶學性質表征以及分子結構的研究進展。新酶源的開發雖然可以為工業生產及人體需求提供具有特殊適應性的酶（比如耐熱酶等），但是由于β-半乳糖苷酶催化機制中存在產物水解與轉糖苷合成的動態平衡以及底物抑制等因素，限制了酶的催化效率（包括水解催化及轉糖苷催化兩個方面），也制約了β-半乳糖苷酶的實際應用。因此，實現β-半乳糖苷酶從理論研究到生產應用的轉化還需要依靠有效的分子調控。與β-半乳糖苷酶新酶源的開發相比，基于“結構-功能”關系的分子調控研究相對滯后。根據CAZy（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZymes）數據庫統計，到目前為止已有酶學性質表征的β-半乳糖苷酶達到240個以上，而具有晶體結構數據的酶尚不足20個。這種酶學特性研究數據相對豐富，而結構數據不足的研究現狀一定程度制約了對β-半乳糖苷酶催化活性調控的研究進展。因此，如何將已有豐富的酶學性質數據資源與不斷積累的分子結構與功能信息相結合，深入研究催化機理與調控機制，最終實現β-半乳糖苷酶催化效率的有效調控，是β-半乳糖苷酶研究領域具有生命力的探索方向。

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