來源于Bacillus circulans的重組β-CGT酶的分離純化及其生化性質分析

李才明 ， 黃 敏 ， 顧正彪 ， 洪 雁 ， 程 力 ， 李兆豐 *

（1．江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫214122）

環糊精（Cyclodextrin），又稱 Schardinger糊精、環聚葡萄糖等，是由6個及以上D-吡喃葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵連接而成的環狀低聚物[1-3]。最常用的環糊精主要有3種，為α-、β-和γ-環糊精，分別由6、7和8個葡萄糖殘基分子構成，這3種環糊精又統稱為基礎環糊精[4]。環糊精的空間結構呈中空圓筒形[5]，其外部含有葡萄糖單元C-2、C-3以及C-6的羥基，導致外部親水；而其內腔含有醚鍵氧原子以及C-3和C-5上的氫原子，所以內腔疏水[6]。正因為這種特性，使得環糊精在食品、農業、生物、醫藥、化工等領域具有廣泛的用途[7-9]。

環糊精的工業化生產均采用酶法工藝，即在環糊精葡萄糖基轉移酶（EC2.4.1.19，Cyclodextrin glucanotransferase或Cyclodextringlycosyltransferase，簡稱CGT酶）的催化作用下通過環化反應轉化淀粉或相關基質而生成環糊精[10-12]。根據CGT酶催化反應初始階段所產生主要環糊精的種類，可將CGT酶分為3種類型，即α-CGT酶、β-CGT酶、γ-CGT酶[13]。

在前期研究中，來源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶成功在枯草芽孢桿菌B.subtilis WB600中實現了胞外過量表達，為其工業化生產及應用打下了基礎。為了促進重組β-CGT酶在工業上的應用，有必要全面分析其生化性質。雖然來源于B.circulans的β-CGT酶的一些生化性質已有報道[14-17]，但關于其不同pH下的熱穩定性、酶濃度對其熱穩定性的影響尚未見報道，而且有關金屬離子對β-CGT酶環化活力影響的報道也不是很全面，尤為明顯的是，大部分針對生化性質的研究主要是圍繞CGT酶的水解活力進行開展，而非以其特征反應的環化活力為指標進行評價。研究報道顯示，CGT酶催化水解反應和環化反應的最佳條件存在明顯差異[18-19]，而環化反應是其工業應用的基礎，因此，有必要以環化活力為評價指標對β-CGT酶的生化性質進行全面分析。

作者主要對重組β-CGT酶發酵上清液進行分離純化，然后以環化活力為評價指標全面分析其生化性質。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質粒和菌株 環狀芽孢桿菌B.circulans STB01、E.coli JM109、宿主菌 B.subtilis WB600、質粒pST均保藏于本實驗室。

1.1.2 主要試劑與材料 酵母粉和胰蛋白胨：購自英國 Oxoid 公司；α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、牛血清蛋白標準品：購自Sigma-Aldrich（上海）公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）和標準相對分子質量蛋白：購自碧云天生物技術研究所；卡那霉素、赤霉素：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；疏水色譜填料Phenyl HP、強陰離子交換色譜填料Q-HP：購自美國Amersham公司；麥芽糊精（DE=5、15、25）：購自法國羅蓋特公司；其它化學試劑均為國產或進口分析純。

1.1.3 主要儀器 PTC-200型基因擴增儀：美國MJ Research公司產品；CR21GIII冷凍立式離心機：日本Hitachi公司產品；蛋白核酸定量測定儀：德國Eppendorf公司產品；GelDoc凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司產品；905型超低溫冰箱：美國Thermo scientific公司產品；Mini Protein 3蛋白電泳系統：美國Bio-Rad公司產品；DAMN HELEOS-II多角度激光光散射凝膠色譜系統 （配：Waters 1525 Binary HPLC泵、Wyatt Optilab T-rEX折光率檢測器、Waters 2489紫外檢測器、DAMN HELEOS-II Wyatt MALLS檢測器）：美國Wyatt Technology公司產品；高效液相色譜 （HPLC）系統： 美國 Agilent Technolodies公司產品。

1.1.4 培養基 種子培養基為LB培養基，發酵培養基為TB培養基，固體平板培養基為添加質量分數1.5%瓊脂的LB培養基；培養基的具體配制方法參照文獻[20]進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組β-CGT酶的生產

1）種子培養 將-80℃冰箱中保藏的甘油管菌株接100 μL至裝有50 mL LB培養基的250 mL三角瓶中，接種量為體積分數0.1%，37℃搖床（200 r/min）培養過夜。接種前添加終質量濃度為5 μg/mL的卡那霉素和赤霉素。

2）發酵培養 將LB培養基中活化的枯草桿菌種子液以體積分數4%的接種量接入裝有50 mL TB培養基的250 mL三角瓶中，37℃搖床 （200 r/min）振蕩培養48 h，接種前添加終質量濃度為5 μg/mL的卡那霉素和10 μg/mL的赤霉素。

發酵培養結束后，將發酵液于4℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液即為重組β-CGT酶粗酶液。

1.2.2 重組β-CGT酶的純化 β-CGT酶的純化采用兩步法：

第一步，疏水Phenyl HP柱（CV 50 mL）。緩沖液 A1為含 1 mol/L （NH4）2SO4的磷酸緩沖液（10mmol/L，pH 6.5），緩沖液 B1為 10 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 6.5）；重組β-CGT酶粗酶液在10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）中透析48 h，一邊攪拌一邊緩慢加入 （NH4）2SO4固體至終濃度為1 mol/L，經0.45 μm微孔濾膜過濾；用5個柱體積的緩沖液A1平衡疏水Phenyl HP柱；上樣，流速為10 mL/min；分別用（NH4）2SO4（0.8、0.6、0.4、0.2 mol/L）、緩沖液 B1、超純水、0.5 mol/L NaOH進行梯度洗脫，流量為10 mL/min。

第二步，強陰離子交換Q-HP柱（CV 20 mL）。緩沖液A2為10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5），緩沖液B2為緩沖液A2+1 mol/L NaCl；含有β-CGT酶的組分在緩沖液A2中透析48 h，上樣，流量為5 mL/min；分別用 NaCl（0.1、0.2、0.3、0.5、1 mol/L），0.5 mol/L NaOH進行梯度洗脫，流量為5 mL/min。

β-CGT酶通過測定酶活和SDS-PAGE進行鑒定，純化β-CGT酶超濾濃縮后分裝，-80℃保存。

1.2.3 β-環化活力的測定 β-環化活力的測定采用酚酞法并作適當修改[21-22]，取適當稀釋的酶液0.1mL，加入裝有0.9 mL預先用10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）配制的 1 g/dL麥芽糊精（DE=5）溶液的試管中，在50℃下反應10 min后，加入3.5 mL 30 mmol/L NaOH和0.5 mL由5 mmol/L Na2CO3溶液配制的0.02 g/dL酚酞溶液停止反應，在室溫下保溫20 min，在550 nm下測定吸光度。以失活的酶作為空白。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成 1 μmol β-環糊精所需的酶量。

1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳 SDS-PAGE電泳凝膠采用碧云天試劑盒制備，所用濃縮膠的質量濃度為5 g/dL，分離膠的質量濃度為10 g/dL，具體配方及操作參考產品說明書和相關文獻[23-24]。電泳結束后，用質量分數0.1%考馬斯亮藍R-250對蛋白膠進行染色，并通過Quantity One軟件估算酶蛋白的表觀相對分子質量。

1.2.5 蛋白質濃度的測定 采用Bradford法[25]測定樣品蛋白濃度，以牛血清蛋白（BSA）作為標準品，具體操作參見蛋白濃度檢測試劑盒中的說明書。

1.2.6 β-CGT酶相對分子質量的測定 未變性β-CGT酶的相對分子質量采用多角度激光光散射凝膠色譜系統進行測定：HPLC柱型號：P8514-806Shodex Packed column；樣品質量濃度1.7 mg/mL（溶于 10 mmol/L磷酸緩沖液，pH 6.5），以 BSA（相對分子質量為66 000）作為標準品；測試條件：進樣量0.2 mL，流動相為10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5，含質量分數0.02%NaN3，超聲脫氣處理），流量0.5mL/min，激光波長 658 nm，校正常數 2.5×10-5，數據采集時間間隔1 s；數據處理：采用系統自帶軟件ASTRA 5.3.4進行分析。

變性β-CGT酶的相對分子質量采用SDSPAGE方法估算。

1.2.7 β-CGT酶最適溫度和熱穩定性的測定 在不同溫度（45～65℃）下，按1.2.3的方法測定純化酶的β-環化活力，將酶活最高者定為100%，計算相對酶活，作溫度-相對酶活力曲線，以確定酶的最適溫度。

純化酶（3.2×10-8mol/L）在不同溫度（45、50、55、60℃）下保溫，不同時間點取樣，迅速冰浴冷卻，按1.2.3的方法測定酶的殘余酶活，以未保溫的樣品酶活力定為100%，計算相對殘余酶活，作時間-相對酶活力曲線。

1.2.8 β-CGT酶最適pH和pH穩定性的測定 分別用濃度為10 mmol/L的不同pH值的緩沖液 （檸檬酸-檸檬酸鈉：pH 4～6；Na2HPO4-NaH2PO4：pH 6～8；甘氨酸-氫氧化鈉：pH 8～10）稀釋酶液和配制底物，按1.2.3的方法測定純化酶的β-環化活力，將酶活最高者定為100%，計算相對酶活，作pH-相對酶活力曲線，以確定酶的最適pH。

將純化酶用上述不同pH緩沖液稀釋至濃度約為 3.2×10-8mol/L，60 ℃下保溫 30 min，不同時間點（10、20、30 min）取樣，迅速冰浴冷卻，按 1.2.3 的方法測定酶的殘余酶活，以未保溫的樣品酶活力定為100%，計算相對殘余酶活，作時間-相對酶活力曲線。

1.2.9 金屬離子對β-環化活力的影響 在麥芽糊精 （DE=5）底物中添加一定終濃度的金屬離子，按1.2.3的方法測定純化酶的β-環化活力，以未添加金屬離子的酶活性定為100%。

1.2.10 β-CGT酶產物特異性分析 用10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）配制5 g/dL的麥芽糊精（DE=5）溶液作為底物，加入終濃度為1 U/mL的純化酶，置于40℃搖床（200 r/min）中反應12 h，不同時間點取樣，煮沸滅酶 10 min，加入10 μL糖化酶（100U/mL）糖化 30 min，煮沸滅酶 10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.45 μm超濾膜過濾后，采用高效液相色譜法（HPLC）測定反應液中α-、β-和γ-環糊精濃度。

HPLC測定條件為：Agilent 1260 HPLC系統（配示差折光檢測器），色譜柱Lichrosorb NH2（4.6 mm×150 mm），流動相采用體積分數68%的乙腈水溶液，柱溫為30℃，流量為1 mL/min。

1.2.11 β-CGT酶動力學參數的測定 用10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）分別配制底物濃度為0.1～10 mg/mL的溶液，按1.2.3的方法測定β-CGT酶的酶活，按Lineweaver-Burk雙倒數法作圖，計算酶的動力學參數，包括：米氏常數 （Km）、最大反應速率（Vmax）、催化常數（Kcat）和催化效率（Kcat/Km）。

1.2.12 數據處理 實驗結果為3次平行實驗的平均值，用平均值和標準偏差表示。采用OriginPro 8.0軟件（美國OriginLab公司）分析數據和作圖；顯著性分析（P＜0.05）采用SPSS軟件進行，通過單因素方差分析（ANOVA）、Student-Newman-Keuls（SNK）程序來實現。

2 結果與討論

2.1 酶的分離純化

2.1.1 Phenyl HP柱疏水層析 從圖1（a）可以看出，目的蛋白主要集中在 0.2 mol/L （NH4）2SO4（條帶F）洗脫液中，其次在 0.4 mol/L（NH4）2SO4（條帶 E）洗脫液中也有一定含量，同時酶活驗證也進一步證實了這一點。合并條帶E、F對應的洗脫液，在10mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）中透析48 h，進行下一步陰離子交換層析，以進一步純化目的蛋白。

β-CGT酶的理論相對分子質量為77 300，重組β-CGT酶粗酶液在還原與非還原狀態下的SDSPAGE分析如圖1（B）所示，從圖中可以看出，β-CGT酶蛋白在粗酶液中占主要成分，而且分子間不存在二硫鍵。重組β-CGT酶的純化采用Phenyl HP柱疏水層析和Q-HP柱陰離子交換層析相結合進行。

2.1.2 Q-HP柱陰離子交換層析 從圖2（a）可以看出，經Q-HP柱陰離子交換層析后，目的蛋白幾乎都集中在透過液中（條帶B），且已達到電泳純。收集條帶B對應的酶溶液，進一步超濾濃縮保存。從圖2（b）可以看出，重組β-CGT純酶在還原與非還原狀態下的表觀相對分子質量基本相同，約為76 500，與理論相對分子質量77 300接近，說明分子間不存在二硫鍵，而且酶蛋白分子在溶液中以單聚體形式存在。

重組β-CGT酶粗酶液的純化結果如表1所示，通過測定相應純化步驟中的酶活性及蛋白濃度，最終β-CGT酶的比酶活為296.5 U/mg，純化倍數達到27.2，回收率高達45.3%。

圖1 重組β-CGT酶粗酶液和Phenyl HP柱純化過程的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the crude recombinant β-CGTase and the purification process of Phenyl HP column

圖2 Q-HP柱純化過程和純化酶液的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purification process of Q-HP column and the purified enzyme

表1 β-CGT酶的分離純化Table 1 A summary of the purification steps of β-CGTase

2.2 酶相對分子質量的測定

采用多角度激光光散射凝膠色譜系統進一步測定β-CGT酶蛋白的相對分子質量，結果如圖3所示，經系統自帶軟件ASTRA 5.3.4分析，該酶分子平均相對分子質量為76 600，與SDS-PAGE分析結果相當，接近其理論相對分子質量。多分散性系數Mw/Mn為1.001，說明相對分子質量呈單分散，也進一步驗證了酶蛋白分子在溶液中是以單聚體形式存在。

圖3 多角度激光光散射凝膠色譜圖Fig.3 Multi-angle laser light scattering gel chromatogram

2.3 酶濃度對其熱穩定的影響

酶濃度在其熱穩定性研究中是首先需要考察的一個因素，作者采用10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）將濃縮純β-CGT酶稀釋至4個不同濃度，分別為 2.0×10-6、5.1×10-7、1.3×10-7和 3.2×10-8mol/L，分別研究其60℃下的熱穩定性，結果如圖4所示，β-CGT酶濃度越高，其熱穩定性越好，說明低的酶濃度能夠降低非共價分子間的相互作用。在后續酶熱穩定性的研究中，酶濃度選擇3.2×10-8mol/L。

圖4 β-CGT酶濃度對其熱穩定性的影響Fig.4 Effectofthe enzyme concentration on the thermostability of β-CGTase

2.4 最適溫度和熱穩定性

在不同溫度（45～65℃）下進行酶活力測定，將酶活最高者定為100%，結果如圖5（a）所示，β-CGT酶環化反應的最適溫度為60℃。

圖5 溫度對β-CGT酶活性和熱穩定性的影響Fig.5 Effectsoftemperatureon the activity and thermostability of β-CGTase

β-CGT酶在 45、50、55和 60℃下的穩定性結果如圖 5（b）所示，45、50、55 和 60 ℃時的半衰期分別為 6.8、4.5 h、55.6 min 和 6.5 min，60 ℃保溫 20 min導致酶基本失去活力，說明該酶的熱穩定性較差。

2.5 最適pH和pH穩定性

在不同pH（4～10）條件下進行酶活力測定，將酶活最高者定為100%，結果如圖6所示，β-CGT酶在pH 5～7的范圍內，酶活力較高，其最適pH為6.5；pH低于5或高于7時，β-CGT酶的環化活力下降較快。在相同pH值時，β-CGT酶在甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中的環化活力明顯高于其在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中的環化活力。

圖6 pH對β-CGT酶活性的影響Fig.6 Effects of pH on the activity of β-CGTase

β-CGT酶在不同pH（4～10）條件下的熱穩定性均較差，而且在pH值相同而類型不同的緩沖液中，其熱穩定性也存在明顯差異。在10 mmol/L pH 4～6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，β-CGT酶60℃保溫10 min即幾乎失去活力（數據未顯示）。從圖7（a）和表2可以看出，在10 mmol/L pH 6～8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，β-CGT酶60℃時的熱穩定性隨pH值的升高略有降低；從圖7（b）和表2可以看出，在10 mmol/L pH 8～10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，β-CGT酶60℃時的熱穩定性同樣隨pH值的升高而降低，pH 從 8.0 升高到 10.0 時，t1/2（min，60℃）降低了62.7%。很明顯，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液更有利于β-CGT酶的穩定，暗示了甘氨酸可能能夠提高β-CGT酶的熱穩定性，但后續實驗發現，β-CGT酶在含10 mmol/L甘氨酸的Na2HPO4-NaH2PO4（10 mmol/L，pH 6～8）緩沖液中，其熱穩定性與未添加甘氨酸時幾乎一致（數據未顯示），說明甘氨酸只有在特定的緩沖液、特定的pH條件下才能有利于β-CGT酶的熱穩定性。

圖7 不同pH條件下β-CGT酶的熱穩定性Fig.7 Thermostability of β-CGTase under different pHs

表2 不同pH條件下β-CGT酶60℃下的半衰期Table 2 Half-lives of β-CGTases at 60 ℃ under different pHs

2.6 金屬離子對β-CGT酶環化活力的影響

金屬離子通常能作為酶的輔因子而對其活力產生重要影響，為了驗證β-CGT酶的環化活力是否對金屬離子輔因子存有依賴，將一定終濃度的金屬離子螯合劑（EDTA）加入到β-CGT酶反應體系中，并分析其對β-CGT酶環化活力的影響；同時研究了常規金屬離子，包括：Li+、Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Hg2+和 Fe3+， 對 β-CGT 酶環化活力的影響，結果如圖8所示。EDTA和金屬離子的終濃度分別為10 mmol/L和1 mmol/L，以未添加EDTA和金屬離子條件下的環化活力為100%。每個值為3次平行實驗的平均值，柱狀圖上不同字母表示顯著性差異（P＜0.05）。

圖8 EDTA和金屬離子對β-CGT酶環化活力的影響Fig.8 Effects of EDTA and metal ions on the cyclization activity of β-CGTase

2.7 產物特異性

β-CGT酶催化底物能同時生成α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精，從圖9可以看出，在整個反應過程中，重組β-CGT酶的主要產物均為β-環糊精，其次為α-環糊精，γ-環糊精產量最低；尤其在反應的初始階段，β-環糊精產量急劇增加，這正是定義來源于B.circulans STB01的CGT酶為β-型的根據；隨著反應進行至3 h，3種產物的增加趨于平緩，α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精占總環糊精產物的比例分別為26.9%、56.6%和16.5%，總轉化率為34.7%。

圖9 β-CGT酶在pH 6.5、40℃條件下作用5 g/dL的麥芽糊精（DE=5）生產環糊精Fig.9 Productionofcyclodextrinsbyβ-CGTase incubating with 5%（wet basis，w/v） maltodextrin（DE=5） at pH 6.5 and 40 ℃

2.8 動力學分析

為了進一步確定重組β-CGT酶的動力學性質，分別測定了以不同濃度的玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、可溶性淀粉或3種麥芽糊精（DE=5、15、25） 為底物時酶的 β-環化活力， 通過Lineweaver-Burk雙倒數法作圖，計算酶的動力學參數。從研究結果發現，當分別以玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉為底物時，環化反應的動力學性質不符合米氏方程（數據未顯示）。而分別以可溶性淀粉或3種麥芽糊精為底物時，環化反應的動力學性質能用米氏方程很好的進行描述 （相關系數R2＞0.99），酶的動力學參數計算結果如表3所示。

表3 以可溶性淀粉或麥芽糊精為底物時β-CGT酶的動力學參數*Table 3 Kinetic parameters of β-CGTases with soluble starch or maltodextrin as the substrate

從表3可以看出，可溶性淀粉的Km值平均值最低，說明β-CGT酶與可溶性淀粉的親和性最大，盡管與DE 5、DE 15的麥芽糊精Km值沒有顯著性差異，以可溶性淀粉或DE 5麥芽糊精為底物時，酶的催化效率（Kcat/Km）最高，隨著麥芽糊精DE值的增大，酶的催化效率顯著降低，說明低DE值的麥芽糊精更適合生產環糊精。

3 結語

對獲得的重組β-CGT酶發酵上清液進行分離純化，然后以環化活力為評價指標全面分析了其生化性質。結果表明，采用Phenyl HP柱疏水層析、QHP柱陰離子交換層析兩步能很好的對重組β-CGT酶進行純化，酶的回收率達到45.3%。重組β-CGT酶的表觀相對分子質量約為76 500，且在溶液中是以單聚體形式存在。該酶的最適pH為6.5，在甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中體現出更好的熱穩定性；最適溫度為60℃。45、50、55、60℃下的半衰期分別為6.8 h、4.5 h、55.6 min 和 6.5 min；60 ℃下的熱穩定性隨酶濃度的升高而增大。該酶的活性不依賴于金屬離子，1 mmol/L Li+、Mg2+、Zn2+和 Hg2+對該酶的 β-環化活力有抑制作用，而1 mmol/L Ca2+和Ba2+能明顯激活酶的β-環化活力。以玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉為底物時，該酶環化反應的動力學性質不符合米氏方程；而分別以可溶性淀粉、麥芽糊精（DE 5、15、25）為底物時，其環化反應的動力學性質能用米氏方程很好的進行描述。

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