洪澤湖濕地不同植物作用下沉積物細菌群落結構

伍賢軍 ，楊 紅 ，程 睿 ，盛 怡 ，韓建剛 ，李萍萍 *

（1.南京林業大學生物與環境學院，南京 210037；2.南京林業大學江蘇省南方現代林業協同創新中心，南京 210037）

自然濕地是具有獨特結構與復雜功能的生態系統，在維持地球生態平衡，保護生物多樣性，促進元素生物地球化學循環等方面發揮著重要作用。江蘇淮安洪澤湖濕地是我國第四大淡水湖泊，自然環境條件獨特，濕地生物資源十分豐富。主要的植物種類有蘆葦、荷花、水花生、茭草、浮萍、金魚藻、菹草等[1]，尤以挺水植物蘆葦、荷花和茭草分布較廣，植物群落結構比較簡單。研究表明，植物對湖泊沉積物有機質的含量有顯著影響，水生植物的沉積是湖泊沉積物有機碳和氮的主要來源[2]。同時，沉積物中的有機碳和氮顯著影響微生物生物量、群落結構及多樣性[3-5]。不同植物類型由于生物量、生長發育期和凋落物性質等不同，對沉積物有機質的貢獻存在差異，對自然界的碳氮循環也造成不同的影響。在不同植物的影響下，沉積物有機質含量的差異也會帶來微生物群落結構的差異，這種差異展現出來的某些功能菌（比如反硝化細菌）則加速了碳氮循環的進程。目前雖然對植物和有機質，微生物和環境因子，植物和微生物之間的相互關系有較多的研究[6-7]，但是對植物-有機質-微生物三者之間的相互關聯缺乏認識，對不同植物影響沉積物微生物群落結構的機制尚不明確。另外，微生物在濕地沉積物微環境中扮演著極為重要的角色，如植物殘體的分解、污染物的去除、營養元素的物質循環等。對微生物群落結構的解析將為揭開濕地生物反應器這個“黑匣子”的運行機制提供數據基礎，為了解濕地環境中微生物與植物，微生物與環境因子，以及微生物之間的相互關系提供依據。

解析濕地沉積物微生物群落結構的方法多種多樣[8]，如末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）技術[9]，基于16srRNA和功能基因的RT-qPCR方法[10]，磷脂脂肪酸（PLFA）技術[11]以及PCR-DGGE的方法[12]等，這些方法存在檢測到的微生物種類不多，微生物分類水平較低等缺陷。近年來，高通量測序技術得到了快速發展，已經逐步應用到生物、醫學、農業、食品、環境等各個研究領域[13-17]?；谏锘瘜W手段的PLFA技術以及傳統的Q-PCR、TGGE、DGGE等分子生物學方法盡管在環境微生物群落結構研究方面仍然十分有效，但利用高通量測序技術對濕地微生物群落結構進行更為精細的分析十分必要。

本論文研究目的是利用高通量測序技術對洪澤湖濕地西南部河湖交匯區蘆葦、茭草和荷花3種不同植物分區沉積物細菌群落結構進行分析，揭示其細菌群落組成和豐度，探討沉積物細菌群落特征、植物種類、有機質含量三者之間的相互關聯，為理解洪澤湖濕地碳氮的生物地球化學循環，挖掘濕地微生物功能奠定基礎，為污染物的植物、微生物修復技術提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

洪澤湖濕地處于淮河中下游（33°6′~33°40′N，118°10′~118°52′E），主要分布在環湖地區。其西南部老子山鎮是淮河與洪澤湖的交匯地區，具有較為復雜的地理環境因素、特殊的生物資源以及微生物種類。本文以洪澤湖西南部的河湖交匯區（33°12′N，118°33′E）為研究區域。如圖1所示，該研究區分布著蘆葦、茭草和荷花3種植物群落。3種植物區間隔明顯，沒有其他的植物類型，面積較大，植物長勢較為一致，水流較慢。利用5點取樣法[18]，于2015年5月在荷花區、茭草區和蘆葦區分別采取沉積物樣品，采樣深度為沉積物表層0~5 cm，將每個區的5個樣品混合成一個樣品?；旌蠘悠分糜跓o菌的50 mL離心管中，并被命名為S1、S2和S3。3份沉積物樣品當天帶回實驗室，-20℃保存。

1.2 理化性質的測定

圖1 采樣點示意圖Figure 1 Map of sampling sites

沉積物樣品在4℃下解凍。采用魯如坤[19]描述的方法對樣品進行預處理。總有機碳（Total organic carbon，TOC）采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法（F-HZ-DZ-TR-0046）；總氮（Total nitrogen，TN）采用凱氏定氮法（GB 7848—1987）；硝酸鹽氮（Nitrate nitrogen，NO3-N）采用HACH分光光度計法8507（HACH DR/2400）；氨氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）采用 HACH分光光度計法8038（HACH DR/2400）；總磷（Total phosphorus，TP）采用堿熔-鉬銻抗分光光度法（HJ 632—2011）測定。樣品的理化性質指標進行2次重復測定（取2次測定結果平均值）。運用SPSSStatistics 17.0統計軟件進行數據分析。

1.3 基因組DNA的提取

采用天根生化科技（北京）有限公司的土壤微生物基因組DNA提取試劑盒（DP336）的方法，稱量0.5 g沉積物樣品，按試劑盒的實驗步驟提取沉積物微生物的總DNA。獲得的總DNA樣品純度和質量通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。DNA濃度通過Nano Drop ND-1000微型分光光度計測定。

1.4 PCR擴增及高通量測序

為了構建細菌群落的基因文庫進行高通量測序，選擇細菌16SrRNA的V4-V5可變區作為測序的目標序列。利用通用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和 907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′），以提取到的總DNA樣品為模板PCR擴增。PCR反應體系為 50 μL，包含有 0.2 μmol·L-1的引物，10 ng的DNA 模板，0.25 mmol·L-1dNTPs，1×PCR 反應緩沖液，2U的快速PfuDNA聚合酶（天根公司，北京）。PCR擴增使用的儀器為ABI GeneAmp 9700（USA）。使用的反應條件為：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30個循環；72℃延伸 10 min。PCR產物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后，通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根公司，北京）對目標條帶進行純化。對純化的PCR產物進行濃度的測定，以達到高通量測序的要求。將PCR產物樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，在Ilumina-Miseq平臺上進行高通量測序。

1.5 測序數據處理

測序得到的序列通過以下方法利用Trimmomatic軟件進行質控過濾：（1）過濾read尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的read；（2）根據 PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小overlap長度為10 bp；（3）拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列。根據序列首尾兩端的barcode和引物序列區分樣品得到有效序列，并校正序列方向。利用Usearch（vsesion 7.1）軟件按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列。采用RDPclassifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在門和屬的水平上統計每個樣品的群落組成。選用相似水平為97%的OTU樣本，統計多個樣本中所共有和獨有的OTU數目表，繪制OTU分布韋恩圖[20]。對復雜數據降維，運用方差分解，將多組數據的差異反映在二維坐標圖上，繪制PCA圖[21]。用顏色變化來反映二維矩陣中的數據信息，并將數據進行物種或樣本間豐度相似性聚類，繪制群落的結構熱圖[22]。

2 結果分析

2.1 樣品理化指標

為了解研究區沉積物的生理生化條件，我們分析了沉積物樣品S1、S2和S3的某些理化指標。如表1所示，S1 的總有機碳（TOC，0.66 g·kg-1）、總氮（TN，0.08 g·kg-1）、氨氮（NH3-N，5.53 mg·kg-1）和硝酸鹽氮（NO3-N，1.47 mg·kg-1）含量都明顯低于 S2 及S3，特別是總氮（TN）含量只有 S2（0.44 g·kg-1）的 1/5 左右。結合ANVOA方差分析，如表2所示，S1、S2和S3的碳氮含量差異顯著（P<0.05），其中S1和S2的差異最大，S2和S3的差異次之，S2和S3的差異最小。3個樣品總磷（TP）含量無顯著性差異（P>0.05）。表明在同一片水域受外來影響相同的情況下，植物種類可能影響到沉積物有機質的含量，這些有機質是植物本身凋落或死亡的殘體，對沉積物中的氮碳含量有著重要的影響。

2.2 測序結果的質量分析

沉積物樣品S1、S2和S3分別得到19 522、17 697和14 785條有效序列，獲得1494、1503、1600個OTU。通過輸入序列數目（小于總的樣本序列條數）與OTU個數產出間的相互關系，繪制稀疏曲線。根據各樣本的測序量在不同測序深度OTU個數不再有升高的趨勢來表明測序數據是否完全覆蓋微生物群落全部的多樣性。由圖2可知，所有樣品曲線均趨于平緩，這表明實際測序量完全覆蓋了群落物種的組成，可以真實反映群落各物種間的相對比例關系。

2.3 不同植物作用下沉積物微生物多樣性

對單樣品的α多樣性分析可以反映微生物的豐度及多樣性，包括利用Chao值、Ace值、Shannon值和Simpson值等一系列統計學分析指數對微生物多樣性的大小進行估算。Chao值、Ace值和Shannon值越大，Simpson值越小，說明樣品中物種越豐富。如表3所示，Chao值和Ace值蘆葦區S3最高，茭草區S2其次，荷花區S1最低，從Shannon指數和Simpson指數來看，微生物物種豐度也表現為S1

表1 洪澤湖濕地沉積物的理化特征Table 1 Physicochemical properties of sedimentsfrom Hongze Lake wetland

表2 沉積物理化特征差異顯著性比較Table 2 Comparison of differencesignificant of physicochemical propertiesof sediments

2.4 不同植物作用下沉積物微生物群落組成

將3種沉積物樣品S1、S2和S3獲得的OTU進行注釋，統計在門類別上的物種組成，如圖3所示。共有14個門的物種占所在樣品的比例在1%以上。3種沉積物樣品都以變形菌門（Proteobacteria）為優勢菌群，占所在樣品的比例均接近50%。其他的主要菌群為綠彎菌門（Chloroflexi，占 7.2%~14.7%）、酸桿菌門（Acidobacteria，占9.47%~12.18%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，占 6.14%~7.15%），擬桿菌門（Bacteroidetes，占4.14%~4.34%），不同的植物類型之間以上菌群占所在樣品的比例均表現出一定的差異。而更大的差異來自厚壁菌門（Firmicutes）。荷花區沉積物樣品S1的厚壁菌門（Firmicutes）占所在樣品的比例高達10.48%，而茭草區S2、蘆葦區S3的厚壁菌門（Firmicutes）非常少（占1%左右）。這表明荷花區沉積物的微生物群落組成與蘆葦區、茭草區比較具有明顯的差異，而厚壁菌門（Firmicutes）豐度高是其主要的特征。3種沉積物樣品中還含有一定比例的綠菌門（Chorobi，占 2.38%~2.87%）、浮霉菌門（Planctomycetes，占 1.79%~2.31%）、放線菌門（Actinobacteria，占1.15%~2.18%），各樣品所占比例相差不大。另外，沉積物中也有Latescibacteria、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、螺旋菌門（Spirochaetae）、Aminicenadetes的細菌，但豐度很低，有些占所在樣品的比例不到1%。

圖2 洪澤湖濕地沉積物稀釋性曲線Figure2 Rarefaction curvefromsedimentsof Hongze Lakewetland

3種沉積物樣品中微生物群落在屬分類水平上的分布情況如圖4所示。其中硝化螺旋菌屬（Nitrospira）在3種沉積物樣品中都占有較大優勢（6.14%~7.14%）。其在沉積物環境中起主要的硝化作用，可把亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽[23]，最近發現某些硝化螺旋菌也能展現完全的硝化能力，直接把氨鹽氧化成硝酸鹽[24]。亞硝酸單胞菌（Nitrosomonadaceae）也占有較高的比例（2.36%~3.45%），負責把氨鹽氧化成亞硝酸鹽[25]。這些細菌在3種沉積物樣品中的豐度未表現出明顯的差異，植物類型對其豐度影響不大。S2和S3還含有相當比例的Nitrospinaceae，分別占2.25%和2.36%，而荷花區S1豐度較低，占1.24%，它們在環境中也具有一定的硝化作用。3種沉積物樣品含有豐富的厭氧繩菌科（Anaerolineaceae），它們在S2和S3中的比例高達8.85%和9.1%，而在S1中也偏低，占4.86%。厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）是嚴格的厭氧菌，屬于綠彎菌門（Chloroflexi），在產甲烷烷烴降解中扮演重要的角色[26]。比較而言，與甲醇代謝有關的嗜甲基菌（Methylotenera）含量在S1中的豐度較高，所占比例達到5.77%，而在S2和S3中僅占0.5%和0.3%。同樣的情況出現在厚壁菌門（Firmicutes）的芽孢桿菌（Bacillus）和乳球菌（Lactococcus）上，它們在 S1中含量為4.47%和3.61%，而在S2和S3中僅為0.1%和0.3%，這與厚壁菌門（Firmicutes）在S1中的含量遠高于S2和S3的結果一致。除此之外，S1含有相當比例的假單胞菌（Pseudomonas，1.87%），而 S2和 S3幾乎沒有。另外，沉積物樣品S1、S2和S3中還含有3.88%、5.74%和7.63%的黃色單胞菌目（Xanthomonadale）的細菌。其他的微生物主要還有叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）、嗜氫菌科（Hydrogenophilaceae）、未分類的 Latescibacteria、福格斯氏菌（Vogesella）、噬纖維菌科（Cytophagaceae）等，它們在某些樣品中占的比例也在1%以上。以上結果表明，荷花區沉積物S1與蘆葦或茭草區沉積物S2或S3在細菌群落組成上存在較大差異，其嗜甲基菌（Methylotenera）、芽孢桿菌（Bacillus）、乳球菌（Lactococcus）和假單胞菌（Pseudomonas）豐度高出蘆葦區或茭草區的10倍以上。

表3 洪澤湖濕地沉積物細菌多樣性指數Table3 The bacterial diversity index fromsediment samples of the Hongze Lakewetland

圖3 洪澤湖濕地沉積物微生物群落結構組成分布（門水平）Figure3 Bacterial community composition at phylumlevel in sediment samplesof the Hongze Lake wetland

圖4 洪澤湖濕地沉積物微生物群落結構組成分布（屬水平）Figure 4 Bacterial community composition at genus level in sediment samplesof the Hongze Lake wetland

2.5 不同植物作用下沉積物微生物群落相似性分析

維恩圖是用封閉曲線直觀地表示集合及其關系的圖形，通過維恩圖可以展示3個沉積物樣品之間OTU的相似性及分布情況。如圖5所示，S1和S2共有 OTU為 890，S2和 S3共有 OTU 為 952，S1和 S3共有OTU為959，3個樣品共有的OTU數目則為836，主要是硝化細菌。S1獨有的OTU為73，S2獨有的OTU為23，S3獨有的OTU為16，表明S1具有較多獨特的微生物種類，主要是嗜甲基菌（Methylotenera）、假單胞菌（Pseudomonas）以及厚壁菌門（Firmi cutes）的細菌。基于OTU的主成分分析表明樣品菌落之間的差異，如圖6所示，在橫坐標方向，物種累計方差貢獻率達到76.59%，沉積物樣品S2、S3相距較近，而與S1相距較遠，表明S1與S2、S3都具有較大差異，即荷花區沉積物與蘆葦區和茭草區比較，細菌群落結構具有較大差異。

微生物結構熱圖可以反映樣品之間的物種組成和差異，也可以對物種和樣本進行聚類分析。如圖7所示，在屬的分類水平上，對總豐度前25的物種進行熱圖分析表明，S1和S2、S3在物種組成上具有較大差異，這種差異主要表現在S1含有較多的嗜甲基菌（Methylotenera）以及厚壁菌門的芽孢桿菌（Bacillus）和乳球菌（Lactococcus），而S2和S3這些菌群則很少。樣品聚類分析也顯示S2和S3群落結構具有比較高的相似性，它們與S1存在一定的差異。物種聚類分析表明：芽孢桿菌（Bacillus）和乳球菌（Lactococcus）、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）和硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、未分類的Latescibacteria和Acidobacteria群落分布較為類似，它們在沉積物中的功能可能具有一定的相關性。

圖5 洪澤湖濕地沉積物中微生物OTU分布Venn圖Figure5 Venn diagramof bacteriafromsedimentsof the Hongze Lakewetland

圖6 洪澤湖濕地沉積物微生物群落組成的UniFrac PCA分析Figure 6 The weighted UniFrac PCA analysisof thebacterial community fromsedimentsof the Hongze Lakewetland

圖7 沉積物微生物群落組成熱圖（屬水平）Figure 7 Heat map showing bacterial composition fromsediments on genus level

3 討論

濕地植物對湖泊沉積物中有機碳和氮的含量有重要的影響。研究表明，濕地植物的存在顯著地增加了沉積物中碳氮的含量，湖泊內部水生植物的殘體沉積是沉積物有機質的主要來源，不同的植物類型與沉積物有機質的含量密切相關[27-28]。在同一片區域，可以認為外源有機碳和氮影響一致，僅植物種類影響沉積物的碳氮含量。在本研究中，荷花區沉積物的總有機碳、全氮、氨氮和硝酸鹽氮比蘆葦區、茭草區要低得多，存在極顯著的差異。這可能與它們不同的生物量有關。在洪澤湖濕地，蘆葦的生物量大于荷花的生物量[29]，蘆葦凋落物和殘體沉積的量應大于荷花的量，其凋落物的性質也可能具有一定的差異，而凋落物和殘體沉積是有機質的主要來源[30]。茭草和蘆葦的碳氮含量沒有顯著差異，推測它們具有相近的生物量，但還需要更多的實驗證實。環境因子與沉積物微生物群落結構密切相關，這些因子包括有機質、重金屬、酸堿度、含水率以及氧化還原電位（ORP）等，碳氮含量是影響微生物群落結構主要的環境因子[31]。在本研究中，碳氮含量較低的荷花區沉積物細菌群落結構與碳氮含量較高的蘆葦區或茭草區具有明顯差異，這表明水生植物通過改變沉積物有機質的含量影響其微生物群落結構，而不同的植物產生有機質含量的差異是造成沉積物微生物群落結構差異的重要原因。具體來看，碳氮含量較低的荷花區沉積物含有豐富的厚壁菌門（Firmicutes），碳氮含量較高的蘆葦區和茭草區則都很少。這種極為顯著的差異也表明沉積物有機質和厚壁菌門（Firmicutes）的細菌具有更為密切的關聯。從分類學水平更高的屬上看，厚壁菌門（Firmicutes）的芽孢桿菌和乳球菌在荷花區沉積物中具有相對高的豐度。對于濕地沉積物中有機質和這類細菌關系的機制尚不清楚。荷花區沉積物也還含有較高的假單胞菌（Pseudomonas）、嗜甲基菌（Methylotenera），這些菌株在蘆葦區、茭草區沉積物中含量則極少。有機質對微生物結構多樣性的影響必然引起微生物功能多樣性的變化。研究表明，芽孢桿菌（Bacillus）具有較強的好氧反硝化能力，在反硝化細菌群體中占據了較大的比重[32]。假單胞菌（Pseudomonas）也是常見的反硝化細菌，很多的反硝化菌被鑒定為熒光假單胞菌、施氏假單胞菌、惡臭假單胞菌、硝基還原假單胞菌和嗜麥芽假單胞菌等[33]。嗜甲基菌（Methylotenera）是一種最新發現的與甲醇代謝有關的變形菌，同時具有反硝化能力[34]。因此，可以推測，荷花區沉積物存在較強的好氧反硝化過程，具有更強的反硝化潛力，有利于富營養化湖泊中氮素的去除，加速氮元素的生物地球化學循環，但仍需更多的實驗證實。

相對于荷花，蘆葦和茭草沉積物相對豐富的有機質含量必然會引起好氧環境的減弱和厭氧環境的增強，這可能是好氧反硝化在荷花區較強的原因。這種好氧環境和厭氧環境的此消彼長也能很好地解釋為何蘆葦和茭草沉積物均含有相當高比例的厭氧蠅菌科（Anaerolineaceae）的細菌，而荷花區比例較低。

4 結論

（1）在3種植物蘆葦、茭草和荷花區的沉積物中，均以變形菌門（Proteobacteria）為優勢菌群，相對豐度比例相似，都接近50%；硝化螺旋菌屬（Nitrospira）和亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonadaceae）也占有較大的比例，且相對豐度相當。沉積物硝化過程活躍，植物類型對其沒有影響。

（2）在相同的濕地環境中，荷花比蘆葦或茭草具有更低的碳氮水平，更低的細菌豐度及多樣性。與蘆葦和茭草相比，荷花沉積物細菌群落組成呈現出較大差異，出現豐富的厚壁菌門（Firmicutes）的細菌，如芽孢桿菌（Bacillus）和乳球菌（Lactococcus）等。植物通過改變沉積物碳氮含量影響其細菌群落結構，而不同的植物作用下沉積物碳氮含量的差異是造成其細菌群落結構差異的重要原因。

（3）與蘆葦和茭草相比，荷花區沉積物不僅有相對豐富的芽孢桿菌（Bacillus）和乳球菌（Lactococcus），還有高比例的假單胞菌（Pseudomonas）和嗜甲基菌（Methylotenera）等，它們都具有較強的好氧反硝化功能，這暗示荷花區沉積物有更強的反硝化潛力，可為湖泊富營養化的植物修復提供借鑒和參考。

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