術后早期關節腔沖洗對兔前交叉韌帶重建后腱-骨愈合的影響

董向輝,徐翠香,孫正明,常彥海,凌 鳴*

(1陜西省人民醫院骨科,西安 710068;2陜西省臨床檢驗中心;*通訊作者,E-mail:m.ling0114@163.com)

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament,ACL)是膝關節的重要穩定結構之一[1],其損傷多發于運動員及喜愛運動的普通人群中,隨著全民運動的日益展開及民眾健康需求的不斷提高,ACL損傷發病率呈逐年上升趨勢,損傷后韌帶不能自行愈合,需要手術重建[2]。移植物的腱-骨愈合是臨床醫生關心的重要問題,是手術成敗的關鍵。移植物的種類、固定方式、炎性細胞因子和關節滑液的浸泡等是影響ACL重建預后的重要因素[3,4],而外傷、手術刺激、關節內炎癥反應等直接和間接地改變著關節內環境,本實驗在ACL重建基礎上,通過術后早期關節腔沖洗減少滑液及炎癥介質改變關節內微環境的方法,探索其對移植物腱-骨愈合界面的組織學影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

8-10月雄性新西蘭大白兔24只,體質量3-3.5 kg,由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供,隨機編號,分籠飼養,飼養室溫度22-25 ℃,相對濕度40%-60%,每日定時給予紫外線消毒。所有動物術前活動正常,膝關節無腫脹,雙側膝關節抽屜試驗、Lachman征均為陰性。每只動物雙側均建立以踇長伸肌腱為移植物的ACL重建模型。隨機選取一側膝作為實驗組,術后早期給予關節腔沖洗,對側不作處理作為對照組。額外飼養2只并制成模型備用,以便補充動物死亡、傷口感染等引起的標本丟失。

1.2 ACL重建方法

術前準備:3.3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)經耳緣靜脈注射行全身麻醉,用硫化鈉進行膝關節周圍脫毛處理,肌肉注射40萬U青霉素預防感染。

建立模型:常規消毒鋪巾,取膝關節正中切口,顯露前交叉韌帶,在股骨、脛骨附著處將其完全切斷,檢查前抽屜試驗及Lachman征均為陽性,證明前交叉韌帶已完整切除。取脛骨下段內側縱形切口,約2 cm,分離并取出踇長伸肌腱,剔除肌肉部分后對折,兩端均用絲線編織,并在兩端保留10 cm長的縫線以作預張及重建手術時牽引使用,沖洗并縫合切口,測量編織肌腱的直徑,并預張10 min,置于生理鹽水中備用。

屈膝45°,用1 mm的克氏針以原ACL起止點為標記分別鉆取脛骨及股骨骨道,根據測量的肌腱直徑,選取與其直徑相近的鉆頭沿克氏針方向擴大骨髓道,并在骨道出口處鉆取骨橋備用,將移植物經牽引線依次穿過脛骨、股骨骨道,屈膝60°將牽引線穿過骨橋打結固定。再次檢查抽屜試驗前拉及Lachman均為陰性。用雙氧水及生理鹽水清洗傷口,實驗側膝關節放置沖洗管于關節腔內,遠端由切口旁皮下引出并固定于皮膚上,嚴密縫合切口,碘伏消毒后包扎,術后分籠飼養,自由活動。術后實驗組連續5 d每天定時9:00用生理鹽水沖洗關節腔內一次,直至流出液清亮為止,對照組不做處理,并給予40萬U青霉素肌肉注射,連續5 d,預防感染,5 d后拔除沖洗管。

1.3 獲取股骨-移植韌帶-脛骨標本

分別在術后第4,8,12周時,用空氣栓塞法處死8只實驗動物,在脛骨和股骨骨髓道關節外口的遠端和近端2 cm處切斷股骨、脛骨,剔除膝關節周圍除關節囊及韌帶以外的其余軟組織,保留完整的膝關節內結構,標本置于10%的甲醛溶液中固定。

1.4 蘇木精-伊紅染色

剔除標本周圍軟組織,經常規脫鈣處理,進行HE染色。在顯微鏡下觀察腱骨界面愈合過程中的組織學變化,隨機選取5個高倍視野進行成纖維細胞計數,計算平均值。

1.5 統計學分析

2 結果

術后第4周,實驗組移植肌腱與骨髓道貼附較緊密,腱-骨界面之間可見成纖維細胞生長活躍,少量炎細胞存在,有成骨反應及新生血管形成;對照組骨髓道壁與移植肌腱之間部分區域間隙相對較大,連接松散,之間可見少量新生血管、成纖維細胞及較多的炎細胞,炎癥反應明顯(見圖1)。

術后第8周,實驗組髓道壁與移植肌腱間連接緊密,由致密的纖維結締組織構成,以排列規則的膠原纖維為主,可見較多成纖維細胞,炎性細胞減少,靠近骨髓道壁側成骨活躍,分布有較多細胞核呈類圓形的成軟骨細胞,并向肌腱側移行;對照組髓道壁與移植肌腱之間連接相對緊密,成纖維細胞較多,膠原纖維排列紊亂,毛細血管減少,骨髓道壁側可見成骨反應(見圖1)。

術后第12周,實驗組髓道壁與移植肌腱界面區膠原纖維大量產生,排列有序,靠近骨髓道壁側見大量新生骨組織,包含纖維軟骨及鈣化軟骨,部分區域膠原纖維、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨層次較為清晰;對照組髓道壁與移植肌腱界面區連接緊密,膠原纖維較多,排列較規則,髓道側可見成骨細胞增生及成軟骨細胞分布(見圖1)。

ACL重建術后第4，8和12周,實驗組腱-骨界面成纖維細胞生長活躍,膠原纖維排列規則有序,成骨活躍,對照組成纖維細胞相對較少,膠原纖維排列紊亂,成骨反應相對延遲;腱-骨界面成纖維細胞計數結果顯示:實驗組腱-骨界面成纖維細胞計數在各個時間點與對照組相比較,差異存在統計學意義(P<0.01)。ACL重建術后實驗組和對照組腱-骨界面成纖維細胞均逐漸增加,在第8周末最多,此后逐漸下降,但對照組下降更為明顯(見表1)。

ACL重建術后,實驗組腱-骨界面成纖維細胞生長活躍,膠原纖維排列規則有序,成骨活躍;對照組成纖維細胞相對較少,膠原纖維排列紊亂,成骨反應相對延遲圖1 ACL重建術后不同時間實驗組和對照組腱-骨界面組織學形態(蘇木精-伊紅染色,×100)Figure 1 Morphology of tendon-bone interface in experimental group and control group at weeks 4,8,12 after ACL reconstruction (Hematoxylin-eosin staining,×100)

分組4周8周12周實驗組33.25±2.12*45.50±3.46*38.37±1.69*對照組24.75±2.2535.50±1.6029.35±2.49

與對照組相比,*P<0.01

3 討論

前交叉韌帶重建后移植物與骨髓道之間的愈合過程復雜,影響因素較多,比如移植物的類型、微動及應力、固定方式、康復過程、骨髓道位置以及炎性細胞因子和關節滑液的浸泡等。移植肌腱為了適應新的環境一般都要經歷一個組織缺血壞死,新生血管、膠原纖維等新組織長入替代及韌帶塑形改建的過程[5,6]。前交叉韌帶急性損傷期、重建時鉆取骨道引起的骨壞死、關節內清理等直接和間接損傷的刺激均會誘發及加重腱-骨交界面的炎癥反應,而關節液內白細胞、炎癥介質和細胞因子等的濃度變化會明顯影響腱骨愈合,如破骨細胞激活促進骨質吸收,降解骨基質[7]。本實驗通過早期關節腔沖洗來減少術后滑液及炎癥介質以改善關節內環境的方法來觀察其對腱骨愈合的影響。

前交叉韌帶損傷或者重建后關節滑液的量和性質發生明顯改變,ACL損傷患者的關節滑液中IL-1、IL-6、干擾素γ、巨噬細胞炎性蛋白1β及TNF-α等炎癥因子含量較正常顯著增高[8],1周后逐漸降低,但仍高于正常[9]。Xue等[10]對前交叉韌帶斷裂的鼠進行研究后發現MMP的含量顯著增加,并認為是與韌帶愈合差有關,但更為重要的原因是損傷后關節內環境的改變。Demirag等[11]研究兔ACL重建術后用α2巨球蛋白封閉關節滑液中的MMP,實驗組中MMP含量明顯下降,并促進了腱-骨愈合,認為是α2巨球蛋白封閉MMPS或者膠原酶,改變關節內環境的結果。用保留交叉韌帶殘端的方法進行重建可以促進腱-骨愈合,其原因是保留的韌帶殘端可以減少關節滑液向骨髓道中滲漏或反流[12]。

本實驗組織學觀察表明,實驗組的成纖維細胞形成和成骨反應的表現均優于對照組,滑膜爬行覆蓋出現較早,膠原纖維排列規整,腱骨之間貼附連接較對照組緊密。成纖維細胞的數量經統計學分析顯示,隨著術后時間的延長,成纖維細胞呈現逐漸減少的趨勢,但在觀察的各時間點數量上明顯多于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05)。正常前交叉韌帶是由平行走行、波浪狀排列的致密結締組織構成,主要基質成分是膠原纖維[13,14],而成纖維細胞是合成膠原的主要細胞。ACL重建術后移植肌腱缺乏血供,韌帶表面部分纖維束會逐漸壞死,早期不能形成有效的自我修復,術后2周腱-骨界面之間主要被肉芽組織及炎細胞充填[15]。肉芽組織主要是由大量毛細血管及豐富的成纖維細胞構成,隨著時間延長,肉芽組織逐漸成熟為纖維結締組織并已經對移植肌腱形成有效的包裹覆蓋,移植肌腱表面再血管化,成纖維細胞長入,而骨髓道壁側血運豐富,軟骨細胞及成骨細胞增生活躍,向腱骨界面之間的結締組織形成有效的骨長入,形成了術后早期骨組織-結締組織-移植肌腱的結構層次。早期關節腔沖洗后可以明顯減少關節腔內滑液及炎癥介質的量,使其對腱骨界面間的肉芽組織破壞減少,局部成纖維細胞數量明顯優于對照組,膠原纖維規律的排列分布發生更早,從而形成更具方向性的膠原纖維[16]。ACL重建手術后由于直接及間接的損傷引起的關節腔內炎癥反應,關節滑液量明顯增多,滑液中炎癥介質的含量發生明顯改變,各種分解性的酶類增多,平衡失調,關節腔的內環境發生改變,加重關節結構的損傷[17],并且移植韌帶內缺乏血液供應,腱周沒有結締組織包裹,與滑液、炎癥細胞及介質等直接接觸。同時,滑液沿著移植物與骨髓道之間的縫隙流入,對腱-骨界面的愈合產生不利影響[18,19],造成腱-骨愈合進程減慢。由此可見,早期關節腔沖洗可減少關節內滑液及炎癥介質,改善關節內環境,增加腱-骨界面之間成纖維細胞的數量,形成更具方向性的膠原纖維,從而促進腱-骨愈合。

因此,本研究認為,前交叉韌帶重建后可以通過早期關節腔沖洗的方法改善關節腔內環境,促進腱-骨界面膠原纖維形成,進而促進腱-骨愈合。

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