黑曲霉產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶發(fā)酵條件的研究

◎ 林曉華

（安徽糧食工程職業(yè)學院，安徽 合肥 230013）

α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶主要是由黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵生產(chǎn)，目前已廣泛應用于基礎開發(fā)研究領(lǐng)域，主要包括生產(chǎn)低聚異麥芽糖[1-5]、淀粉水解[6]、酒精發(fā)酵、代謝機理研究、食品成分分析和醫(yī)學診斷[7-8]等方面。但目前國內(nèi)生產(chǎn)α-葡萄轉(zhuǎn)糖苷酶酶制劑廠家較少，其發(fā)酵周期較長，所耗的培養(yǎng)基量較多，酶的產(chǎn)量和特性不易控制，因此對于α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶生產(chǎn)成本的控制是各酶制劑廠家急需解決的問題。啤酒廢酵母是啤酒工業(yè)的主要副產(chǎn)物之一。生產(chǎn)100 t啤酒可產(chǎn)1～1.5 t的啤酒廢酵母（以干重計），啤酒廢酵母若直接排棄，必將產(chǎn)生環(huán)境污染，同時給企業(yè)造成經(jīng)濟損失[9-10]。因此，利用啤酒廢酵母開發(fā)高附加值產(chǎn)品已經(jīng)被啤酒同行所關(guān)注。

鑒于此，本文以啤酒酵母自溶物替代微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母浸膏，研究其對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，為啤酒廢酵母的綜合利用提供更為直接和廉價的方法打下良好的理論基礎，在此基礎上對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，得出最佳的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶發(fā)酵工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）菌種、乙酸、乙酸鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸二氫鈉、鹽酸、4-氨基安替比林、苯酚、α-甲基葡萄糖。

1.2 儀器與設備

天平、可見分光光度計、滅菌鍋、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、超凈工作臺等。

1.3 方法

（1）培養(yǎng)基。①菌種斜面培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基。②種子及發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40～50 g/L、酵母膏18 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、尿素2 g/L，pH 5.5～6.0，根據(jù)不同的實驗設計要求，改變培養(yǎng)基的各組分。③酵母自溶物的制備：取啤酒廢酵母按質(zhì)量比1∶1加水稀釋后，添加3% NaCl，調(diào)pH至6.5，50 ℃條件下自溶48 h，取出后至沸水浴中滅酶10 min，冰箱冷藏保存待用。

（2）接種及培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)基接種后至于30 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3 d，取10 mL無菌水用接種環(huán)刮取斜面菌落搖勻后取2.5 mL接種至裝有25 mL培養(yǎng)基的小搖瓶（250 mL）作為一級種子，200 r/min，30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h后，按10%接種量接種到發(fā)酵搖瓶，在溫度為30 ℃，發(fā)酵初始 pH 5.5～6.0，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下發(fā)酵110～120 h取樣測定。

（3）酶活檢測[11]。參考QB 2525-2001《食品添加劑α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶》的方法進行酶活的測定。

1.4 試驗設計

以啤酒酵母自溶物代替酵母膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)單因素試驗確定酵母自溶物的最適添加量。并在此基礎上對黑曲霉培養(yǎng)條件進一步優(yōu)化。通過Design-Expert 7.1（Stat-Ease,Inc.）對實驗所得數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母自溶物添加量對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基按葡萄糖40～50 g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，尿素2 g/L，酵母自溶物作為氮源分別添加80、100、120、140 mL/L和160 mL/L，pH 5.5～6.0，滅菌后接種黑曲霉菌種子培養(yǎng)基，200 r/min，30 ℃恒溫培養(yǎng)120 h后，取發(fā)酵上清液測定α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶活力。同時作對照試驗，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酵母自溶物的添加量對產(chǎn)酶的影響圖

由試驗可知，在酵母自溶物添加量為120 mL/L時，α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶可以達到最大值175 U/mL，而添加酵母膏的對照組在相同培養(yǎng)條件下發(fā)酵所得酶活力為165 U/mL，由此可知，以啤酒酵母自溶物代替酵母膏作為N源是可行的，經(jīng)過與原培養(yǎng)基成本對比，可以減少5%的培養(yǎng)基成本。

2.2 培養(yǎng)條件對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的單因素試驗

以α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶為指標，分別研究了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵初始pH和攪拌速度對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖2所示。

根據(jù)上述單因素試驗的結(jié)果，對發(fā)酵時間、發(fā)酵初始pH、攪拌速度和發(fā)酵溫度進行4因素3水平的試驗，每組2個重復。正交設計表格見表1。

表1 正交試驗因素水平表

發(fā)酵條件對α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶產(chǎn)量的正交試驗結(jié)果如表2所示，由正交試驗結(jié)果可知，各因素影響α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶產(chǎn)量的順序為B＞A＞D＞C，即發(fā)酵初始pH是影響α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶活力的主要因素，其次是發(fā)酵時間，然后是發(fā)酵溫度、攪拌速度，最適發(fā)酵條件為A2B2C2D1，即在發(fā)酵初始pH為6.5，發(fā)酵溫度30 ℃，攪拌速度為200 r/min，發(fā)酵120 h所得的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶活力最高。通過對最佳發(fā)酵條件的組合進行5次驗證性試驗，測得α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶活力的平均值可以達到200 U/mL。

表2 α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶產(chǎn)量的正交試驗結(jié)果表

3 結(jié)論

文章通過對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的條件進行了優(yōu)化，選用了自制的啤酒酵母自溶物替代了商業(yè)酵母膏作為氮源，在此基礎上對α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間，攪拌速度和初始pH等發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，得出了最佳的發(fā)酵工藝，降低了α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的培養(yǎng)基成本，提高了產(chǎn)量。

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