C6-HSL對蜂房哈夫尼菌生物學特性的影響

◎ 劉 麗，牛彤鑫，張公亮，侯紅漫

（大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034）

蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）是一種革蘭氏陰性菌，具有運動性，有鞭毛，是一種兼性厭氧菌[1]。該菌有類似于費氏弧菌的群體感應系統[2]，能夠產生信號分子AHL[3]，通常在存在于自然環境中，尤其是土壤和污水中[4]，能夠從冷藏的牛奶、肉制品以及魚肉中分離獲得[5-7]，能夠產生硫化氫[8]，酸性氣味[9]，是導致食品腐敗變質、影響風味和貯藏時間的重要因素。蜂房哈夫尼菌能夠在低溫環境中生長[1,10]，是導致冷藏食品變質的主要腐敗菌之一。

細菌的群體感應是細菌根據細胞密度變化進行基因表達調控的一種生理行為[9]，細菌通過產生信號分子，信號分子將與受體蛋白結合，從而調控細菌相關基因的表達，使細菌有效抵御外界不利環境[11]。近年來，一些研究表明許多食品腐敗和致病性生物體，如大腸桿菌O157、腸道沙門氏菌、銅綠假單胞菌都受到QS系統的調控，產生許多生理特征，包括產生色素、群集運動、生物被膜形成、分泌毒素以及生產降解酶等[12]。但是外源同種信號分子對于細菌生理特性的研究較少，人們對于外源信號分子對細菌生理特性的調控機制了解有限。

因此，本試驗研究了蜂房哈夫尼野生株以及LuxI基因缺失株（ΔLuxI）所產生信號分子的成分及含量，通過外源添加不同濃度的C6-HSL來研究信號分子對蜂房哈夫尼菌野生株以及ΔLuxI菌體生長、泳動能力、生物膜形成的影響，為進一步揭示蜂房哈夫尼菌群體感應作用機制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂房哈夫尼菌野生株，分離自即食海參；LuxI基因缺失株，（ΔLuxI）由實驗室構建成功（培養時需添加20 μg/mL卡那霉素）；C6-HSL，Sigma公司；乙酸乙酯，天津市東麗區天大化學試劑廠；甲酸，Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

UV 2102 型紫外分光光度計[島津(上海)儀器有限公司]、SpectraMax M2多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、1260高效液相色譜[安捷倫科技（中國）有限公司]、Sorvall ST 16R高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.3 蜂房哈夫尼菌內源信號分子的測定

1.3.1 AHLs粗提液的制備

蜂房哈夫尼菌野生株及LuxI基因缺失株（ΔLuxI）于LB培養基中30 ℃、150 r/min培養后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，將上清液濃縮后與酸化的乙酸乙酯（含0.5%的甲酸）混勻，25 ℃、180 r/min振蕩3 h。靜置將水相和有機相完全分開，收集有機相，使用旋轉蒸發器40 ℃將有機相蒸干。用1 mL超純水溶解提取物，經0.22 μm濾膜無菌過濾，于-20 ℃保存。

1.3.2 高效液相色譜檢測AHLs含量

采用黃旭鎮等[13]的方法并略作修改，采用安捷倫1260高效液相色譜進行分析。液相色譜條件：安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，分析時間25 min，柱溫30 ℃，流動相為乙腈∶水（0～2 min，10%～10%乙腈；2～3 min，10%～5%乙腈；3～5 min，5%～5%乙腈；5～6 min，5%～15 %乙腈；6～15 min，15%～15%乙腈；15～20 min，15%～30%乙腈；20～25 min，30%～50%乙腈）。標準品為C6-HSL。

1.4 細菌生長曲線的測定

將凍存于-80 ℃的蜂房哈夫尼菌野生株及LuxI基因缺失株（ΔLuxI）活化2次后，30 ℃培養16 h備用（后文中的菌液均指蜂房哈夫尼菌野生株以及LuxI基因缺失株ΔLuxI）。將C6-HSL用純凈水稀釋備用。按照4、8、16、32 μmol/L和64 μmol/L的比例分別添加到LB培養基中，以沒有添加C6-HSL的培養基作為空白對照。將菌液1∶100倍稀釋接種到上述LB培養基中，于30 ℃、150 r/min培養，每隔4 h檢測OD600值。

1.5 菌體泳動能力的測定

參照Cong等[14]和Hidalgo等[15]的方法并做適當修改，利用軟瓊脂平板法測定各時間段培養菌液的泳動能力。群體泳動性（swarming）平板的配方為0.3%的瓊脂粉加到LB培養基中。將C6-HSL按照4、8、16、32 μmol/L和64 μmol/L的比例分別添加到LB軟瓊脂平板中，以沒有添加C6-HSL的軟瓊脂平板作為空白對照。將培養16 h的菌液用移液槍吸取3 μL點到上述軟瓊脂平板中心位置，于室溫靜置30 min。待菌懸液充分吸收，將群體泳動性平板置于30 ℃培養72 h，分別于24、48、72 h測定菌株擴散圈的直徑。以擴散群直徑代表菌體泳動能力。

1.6 生物膜的制備和測定

將C6-HSL按照4、8、16、32 μmol/L和64 μmol/L的比例分別添加到LB培養基中，以沒有添加C6-HSL的培養基作為空白對照。將培養好的菌液1∶100倍稀釋后添加到96孔板中。將做好的96孔板置于30 ℃生化培養箱中培養24 h，取出96孔板振蕩混合后測定OD600值，而后進行生物膜測定。

棄96孔板中菌懸液，向每孔添加250 μL PBS清洗3次，之后加250 μL無水甲醇固定15 min后棄之，常溫風干，用0.1 %的結晶紫250 μL染色15 min后棄之，并用去離子水沖洗，自然風干后，用33 %的冰醋酸200 μL溶解，測OD590值[16]。

1.4 數據處理和統計分析

實驗結果用平均數±標準差（x-±SD）表示，使用SPSS 22.0軟件進行數據方差分析及多重比較。

2 結果與分析

2.1 蜂房哈夫尼菌野生株分泌C6-HSL含量的變化

隨著蜂房哈夫尼菌的生長，培養上清液中的C6-HSL不斷增加，在穩定期達到最高含量16.1 μmol/L。在細菌達到衰亡期時，C6-HSL含量急劇下降，其中20 h下降約52%，24 h下降約97%，基本不產生C6-HSL（如圖1所示）。隨著細菌濃度的增加，銅綠假單胞產生AHLs含量逐步增加，在12 h達到最高[13]。銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌以及惡臭假單胞菌隨培養時間的不同，各類AHLs信號分子均呈現由遞增至遞減的規律[17]。

LuxI基因缺失株的生長狀況與蜂房哈夫尼菌野生株相似，但是沒有檢測到C6-HSL，說明LuxI基因控制C6-HSL的產生。因此LuxI基因缺失株ΔLuxI可以用于后續實驗研究。

2.2 C6-HSL對蜂房哈夫尼菌生長的影響

檢測添加不同濃度C6-HSL的蜂房哈夫尼的生長情況，結果如圖2所示。與陰性對照（不添加C6-HSL）相比，添加C6-HSL對蜂房哈夫尼菌野生株的生長影響效果不大。這與Patzelt D[18]等人的研究結果相一致，信號分子對于菌體的生長的影響與信號分子的種類濃度有關，短鏈的高絲氨酸內酯對于細菌的生長影響很小。C6-HSL對LuxI基因缺失株生長的影響效果也很小，如圖3所示。

圖2 C6-HSL對蜂房哈夫尼菌野生株生長的影響圖

圖3 C6-HSL對LuxI基因缺失株生長的影響圖

2.3 C6-HSL對蜂房哈夫尼菌泳動性的影響

由圖4與圖5對比可以發現，缺失LuxI基因后蜂房哈夫尼菌的泳動能力減弱。隨C6-HSL添加量（0～16 μmol/L）的增加，蜂房哈夫尼菌野生株及LuxI基因缺失株的泳動能力呈現上升的趨勢，且這種現象隨時間的延長愈發明顯。但當C6-HSL持續增加（16～64 μmol/L）時，蜂房哈夫尼菌野生株及LuxI基因缺失株的泳動能力出現一定程度的下降。說明C6-HSL對蜂房哈夫尼菌泳動性的影響也在一定程度上受到添加量調控。同樣，AHL對鼠傷寒沙門氏菌群體泳動性的影響受添加量調控[19]。而LuxI基因缺失株加入C6-HSL后同樣要比蜂房哈夫尼菌野生株的泳動性弱，因此推測可能是由于LuxI基因的缺失，導致某些基因表達的改變進而影響菌體的運動能力。LuxI基因對泳動性起正調控作用，而C6-HSL可以促進蜂房哈夫尼菌的泳動性。

圖4 C6-HSL對蜂房哈夫尼菌野生株泳動性的影響圖

圖5 C6-HSL對LuxI基因缺失株泳動性的影響圖

2.4 C6-HSL對蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影響

由圖6可見，LuxI基因缺失株生物膜形成能力比野生型要高。不同濃度的C6-HSL對蜂房哈夫尼菌生物膜形成均有抑制作用，且隨C6-HSL添加濃度的增加，抑制作用呈現先下降后上升的趨勢。當外源添加16 μmol/L C6-HSL時，蜂房哈夫尼菌的生物膜形成量最低。但在添加C6-HSL之后迅速下降，隨著濃度的增加依然呈現先下降后上升的趨勢。當AHLs濃度為0.68 ng/mL時，假單胞的生物被膜形成能力無影響，但當濃度等于或者高于2.03 ng/mL時生物膜形成能力降低[20]。賈坤等[19]發現不同AHL添加量對鼠傷寒沙門氏菌生物膜形成均有一定抑制作用，且隨著AHL添加量的增加，其抑制作用顯著加強。外源AHLs（C4-HSL、C6-HSL）能夠抑制沙雷氏菌以及氣單胞菌生物膜的形成[21]。由此推斷，LuxI基因對生物膜的形成起負調控作用，同樣C6-HSL對對生物膜的形成起抑制作用。

值得注意的是，本次研究中C6-HSL促進蜂房哈夫尼菌的泳動性，但是抑制菌體的生物膜形成。生物膜的形成與細菌的鞭毛、纖毛、群體感應信號分子等具有密切關系，這與鞭毛的運動性對生物膜形成的負調控研究結果相一致，不少細菌的運動性對其表面黏附作用存在抑制作用。研究發現SadB蛋白缺陷菌株鞭毛運動能力增強，生物膜的形成能力反而下降[23]。由此推斷是C6-HSL促進蜂房哈夫尼菌的鞭毛運動能力，從而使細菌表面的黏附作用降低，使得檢測到的細胞膜含量降低。但是具體原因還需要進一步研究。

圖6 C6-HSL對蜂房哈夫尼菌野生株以及LuxI基因缺失株生物膜形成的影響圖

3 結論

蜂房哈夫尼菌群體感應信號分子C6-HSL由LuxI基因控制產生，C6-HSL對菌體的生長影響不明顯，但對菌體泳動性有明顯的促進作用，而對生物膜的形成具有抑制作用。目前，蜂房哈夫尼菌群體感應的研究還十分有限，從整體上闡明群體感應的作用機制是今后的主要研究方向。

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