小興安嶺松木醋液的生物活性及抑菌性能研究

許英梅，何德民，高連連，申東財，樸永哲，張秋民(.大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 6605；.大連理工大學 化工學院，遼寧 大連 604)

抑菌劑包括無機抑菌劑、有機抑菌劑和天然抑菌劑。無機抑菌劑的主要成分是次氯酸鈉(如84消毒液)、過氧化物等，有機抑菌劑的主要成分是合成苯酚類(如來蘇水)、雙呱類、乙基香草醛類化合物等[1-5]。天然抑菌劑主要來自天然植物的提取，如甲殼素、芥末、蓖麻油、山葵等，使用簡便，但抑菌作用有限，耐熱性較差，殺菌率低，不能廣譜長效使用且數量很少。無機消毒劑和合成有機消毒劑雖有較強的抑菌殺菌效果，但均對人體、牲畜有較強副作用，會產生一定程度的傷害，其安全性近年來被科技界所重視。小興安嶺松木醋液是利用森林撫育的枝椏和木材加工殘余物經熱解制氣及生物碳時的回流廢液(占處理量的30%)，是含有機酸、酚、醛等多種成分的稀水溶液，不加以綜合利用，不僅污染環境，還影響該行業的發展和經濟效益。研究表明，精制后的木醋液不僅具有高度安全性[6-7]，而且具有較強的抑菌性[8-10]。本文以小興安嶺松木醋液為原料，研究木醋液的抑菌活性，并對活性組分加以分離，為木醋液在植物基抑菌劑的應用提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 木醋液成分分析

以小興安嶺松木醋液為原料，采用氣相色譜-質譜(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)法分析其成分。首先對木醋液樣品進行分離萃取。取待分析的木醋液樣品5 mL，用無水乙醚10 mL分3次萃取，用量依次為5、3、2 mL，三次萃取后合并乙醚相，接著用適量無水氯化鈣吸水干燥5 min，過濾后得到該木醋液樣品的有機相，待分析。稱量木醋液樣品的質量和分離后的水相質量，以獲得木醋液樣品的有機相重量百分含量。將上述木醋液樣品的有機相用甲醇(色譜純)稀釋5倍，然后進行GC-MS分析。氣質聯用儀(日本島津GCMS-QP2010 Plus型)的色譜條件如下：DB-5MS毛細管色譜柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度230 ℃，載氣He氣，程序升溫40～230 ℃(保持30 min)，檢出器FID。質譜條件：EI源，電子能量70 eV，加速電壓0.9 kV，源溫230 ℃，掃描范圍m/z 10～350。質譜標準庫：NIST庫。

1.2 化學法分離木醋液的活性組分

化學方法分離木醋液分別得到有機酸類和[有機酸類+酚類](主要是乙酸和苯酚)。先將木醋液用一定濃度的氫氧化鈉溶液中和，再用無水乙醚萃取分層，最后將分層所得的水相用適量的鹽酸中和還原，此時得到的水溶液即為木醋液的[有機酸類+酚類]活性組分。同理，采用一定濃度的碳酸氫鈉溶液分離可得到木醋液的有機酸類活性組分。

1.3 抑菌性試驗

1.3.1 培養基

(1)細菌培養基(LB)：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，去離子水1 L，pH 7.4。

(2)酵母菌培養基(Martin)：葡萄糖10 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，磷酸二氫鉀1 g·L-1，硫酸鎂0.5 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，自然pH，去離子水1 L。

(3)雙層平板制備。底層：已滅菌的瓊脂培養基(2.2%)10 mL，待凝固；上層：取已融化的LB培養基(瓊脂含量1.8%)200 mL冷卻至45 ℃左右，與指示菌1 mL(濃度為1%)混勻，快速傾入20～25 mL于底層培養基上，待凝固，作為菌層。

1.3.2 指示菌菌液的制備

以大腸桿菌為例：從大腸桿菌培養皿上挑取典型菌落接種至LB液體培養基試管中，37 ℃下搖床振蕩培養24 h，得到大腸桿菌菌液，待用。其他菌種的培養方法類似，而培養條件不同。

1.3.3 抑菌試驗方法

采用牛津杯法測抑菌圈直徑[11-13]。在無菌操作臺上，首先制作雙層平板，待其凝固后將培養基平皿倒扣，在表面皿的背面標上記號，然后將牛津杯(內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm的圓形金屬小管)垂放在已凝固的培養基中有標記的地方，并用鑷子輕輕的按壓，使牛津杯與培養基直接接觸沒有空隙(防止加入待測液的時候漏出)。用移液槍取待測樣品并加入到牛津杯中，每個牛津杯中大約加入100 μL的待測樣品。每個樣品做3組對照。完成后將培養皿蓋上，放置20 min左右。然后放入恒溫為37 ℃的培養箱中，培養24個小時。在培養的過程中，試驗菌開始生長，木醋液也呈球面開始擴散，木醋液隨著擴散濃度而越來越小直至沒有，所以離牛津杯一定距離的地方會有一條最低抑菌濃度帶，在此范圍內，試驗菌不能生長，是一個透明的抑菌圈。觀察實驗結果，然后用直尺將抑菌圈的直徑量出。

2 結果與討論

2.1 木醋液成分的氣質分析結果

通過分離萃取脫水處理后，得到木醋液的有機相，占木醋液總量的9.80%(質量分數)，有機相經過GC-MS分析，結果如圖1。

由木醋液的總離子流(Total Ion Current，TIC)圖，通過質譜標準譜庫檢索，結合人工解析，共鑒定出47種有機物見表1，包括各種有機酸、酮類、醇類、酚類、酯類及其它復雜有機化合物。

圖1 木醋液的TIC圖

表1 木醋液的GC-MS分析結果

續表1 木醋液的GC-MS分析結果

木醋液有機相中主要活性組分含量見表2。乙酸含量最大為37.21%(保留時間為2.855 min)，總有機酸類含量包括乙酸、丙酸、丁酸和己酸等占42.90%；苯酚含量為3.99%(保留時間為11.847 min)，2-甲氧基苯酚2.59%(保留時間為15.063 min)，還有各種甲基苯酚、二甲基苯酚、甲基甲氧基苯酚、乙基甲氧基苯酚、苯二酚等總酚類化合物占26.68%。

表2 木醋液主要活性組分的含量(有機相)

2.2 木醋液及活性組分對細菌的抑菌效果

選擇四種指示菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌)試驗木醋液及活性組分對細菌的抑菌效果。木醋液對細菌的抑菌結果如圖2。

圖2 木醋液對細菌的抑菌效果

四種指示菌對木醋液都比較敏感，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，而大腸桿菌和普通變形桿菌屬于革蘭氏陰性菌，木醋液在較高濃度下對革蘭氏性狀不同的細菌均有明顯的抑菌效果，說明木醋液具有廣譜抑菌性。對應于木醋液原液濃度的抑菌效果最強，分別是對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為30 mm，對普通變形桿菌的抑菌圈直徑為28 mm，對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為22 mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為18 mm。四種指示菌的抑菌圈直徑受木醋液稀釋倍數(體積比)的影響變化趨勢一致，隨著稀釋倍數的增大，抑菌圈直徑逐漸減小，在木醋液稀釋倍數為10倍之前影響幅度較大，隨木醋液濃度的降低，抑菌效果明顯減弱；在木醋液稀釋倍數為10倍以上影響幅度很小，隨木醋液濃度的降低，抑菌效果差異不大，抑菌圈直徑達到最小值10 mm左右。

將木醋液用化學法分離，分別得到兩組活性組分有機酸類和[有機酸+酚類]，通過對四種指示菌的抑菌性試驗，抑菌效果如圖3。

抑菌效果受稀釋倍數的影響趨勢都與木醋液類似，但抑菌效果明顯不同。例如對屬于革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果顯示，有機酸類的最大抑菌圈直徑分別為28 mm和18 mm，而[有機酸類+酚類]的最大抑菌圈直徑分別為30 mm和22 mm；屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌和普通變形桿菌的抑菌效果顯示，有機酸類的最大抑菌圈直徑分別為14 mm和24 mm，而[有機酸類+酚類]的最大抑菌圈直徑分別為17 mm和26 mm。木醋液活性組分[有機酸類+酚類]的抑菌效果普遍高于有機酸類，說明木醋液的抑菌活性組分不只是有機酸類，而是[有機酸類+酚類]。

圖3 木醋液活性組分對細菌的抑菌效果

將市售84消毒液和來蘇水按照使用濃度測定其對大腸桿菌和普通變形桿菌的抑菌圈直徑，并與木醋液進行比較，結果如表3。木醋液的抑菌效果優于市售84消毒液和來蘇水，是一種很有應用前景的植物基抑菌劑。

表3 不同抑菌劑的抑菌圈直徑

3 結 論

(1)采用GC-MS分析法分析了木醋液中的有機相成分，有機相中乙酸含量最大為37.21%，總有機酸類含量包括乙酸、丙酸、丁酸和己酸等占42.90%，苯酚含量為3.99%，各種甲基苯酚、二甲基苯酚、甲基甲氧基苯酚、乙基甲氧基苯酚、苯二酚等總酚類化合物占26.68%。

(2)采用牛津杯法選擇四種指示菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌)研究木醋液及分離活性組分對細菌的抑菌效果，在較高濃度下對革蘭氏性狀不同的細菌均有明顯的抑菌效果，活性組分[有機酸類+酚類]的抑菌效果普遍高于有機酸類。木醋液的抑菌活性組分不只是有機酸類，而是[有機酸類+酚類]，以有機酸為主，酚類為輔。木醋液作為植物基抑菌劑，其抑菌效果優于次氯酸鈉等化學品類消毒液。

參考文獻：

[1] KUPPUSAMY S , THAVAMANI P , MEGHARAJ M, et al. Bioremediation potential of natural polyphenol rich green wastes: A review of current research and recommendations for future directions [J] Environmental Technology & Innovation， 2015, 4：17-28.

[2] DAS R, DUTTA A, BHATTACHARJEE C. Preparation of sesame peptide and evaluation of antibacterial activity on typical pathogens [J]. Food Chemistry，2012, 131:1504-1509.

[3] GUO B , FAN H X , XIN Q S, et al. Synthesis and biological evaluation of novel benzoxazinyl-oxazolidinones as potential antibacterial agents [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2013, 23：3697-3699.

[4] ZHANG J , ZHAO J W , Wang L P , et al. Design, synthesis and docking studies of some spiro-oxindole dihydroquinazolinones as antibacterial agents [J]. Tetrahedron， 2016, 72:936-943.

[5] CHHABRA M , SINHA S, BANERJEE S, et al. An efficient green synthesis of 2-arylbenzothiazole analogues as potent antibacterial and anticancer agents [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 2016, 26：213-217.

[6] 張善玉,金光洙,金在久，等. 精制木醋液的安全性評價[J].中國野生植物資源，2005,24(2)：54-55.

[7] 陳順偉,邵素芬,莊曉偉，等. 精制竹醋液的安全性毒理學評價[J].竹子研究匯刊，2007,26(3)：41-44.

[8] 尉芹,馬希漢,鄭滔. 核桃殼木醋液的制取、成分分析及抑菌試驗[J]. 農業工程學報，2008，24(7) :276-279 ．

[9] 毛巧芝,趙忠,馬希漢. 杏樹枝木醋液的制取及其抑菌活性和化學成分分析[J].西北農林科技大學學報: 自然科學版，2009，37(10)：91-96.

[10] WEI Q, MA X H, DONG J E. Preparation, chemical constituents and antimicrobial activity of pyroligneous acids from walnut tree branches[J]. J. Anal. Appl. Pyrolysis，2010，87：24-28．

[11] 趙斌,林會,何紹江. 微生物學實驗[M]. 北京:科學出版社,2014:38.

[12] 周德慶,徐德強. 微生物學實驗教程[M]. 北京:高等教育出版社,2013:7.

[13] TALARO K P, CHESS B. Foundations in microbiology basic principles[M]. Beijing:Higher Education Press，2013:1.