上海白豬(上系)基因組遺傳變異檢測與功能注釋分析

盛中華，陳國宏，潘玉春，王起山，張 哲

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009；2.上海市閔行區動物疫病預防控制中心，上海 201109；3.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240)

上海白豬是通過十幾年的選育而培育成的一個地方肉脂兼用型品種，具有肉質好、產仔數較多、胴體瘦肉率較高和耐粗飼等優良特點。早在1986年被收錄至《中國豬品種志》， 2012年列入《上海市畜禽遺傳資源保護名錄》。上海白豬(上系)作為上海白豬的一個品系，曾作為供港豬杜長上雜交組合的母本風靡一時，但隨著引進的國外豬種嚴重地沖擊國內種豬市場，上海白豬(上系)的群體規模受到了極大的影響，各項生產指標出現一定程度的衰退，因此需要深入了解當前群體的遺傳現狀，以便更好地進行提純復壯與開發利用。

遺傳變異的檢測和功能注釋是分析動物群體遺傳現狀的重要前提和基礎，單核苷酸多態性(SNP)和2 bp～1 kb 之間的小片段插入和缺失(InDel)為豬基因組占比最大的兩類分子標記。其中，SNP因具備充足的信息常用于基因連鎖分析和與動植物DNA功能性變異密切相關的連鎖不平衡分析。如H.S.Ai等[1-2]基于全基因組的SNP遺傳標記開展了中國部分地方豬的群體結構和連鎖不平衡分析等。M.Z.Li等[3]利用重測序得到的SNP標記，從群體遺傳學上進一步闡明了藏豬適應高原環境的遺傳機理及杜洛克經人工選擇后與藏豬遺傳上的差異。InDel標記具有較好的穩定性和多態性等優點，頻率僅次于SNP，其中約1/3位于已知的基因區域內，還有一些位于決定基因功能的關鍵性區域如啟動子區和外顯子區，當前已有多個研究組利用基因芯片開展豬抗病、肉質等相關遺傳機制研究[4-6]。Q.Xiao等[7-9]也基于基因組簡化測序技術(GGRS)開展了地方豬和引進豬的SNP和InDel的檢測分析。

本研究針對上海白豬核心群體，采用GGRS測序技術[10-11]，在全基因組范圍內進行SNP和InDel等遺傳變異多態性檢測，并進行系統的功能注釋分析，以便了解上海白豬當前群體的遺傳現狀，進而為其保護和利用提供分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1 上海白豬及對照群體

試驗所用99頭上海白豬的耳組織樣采自上海市閔行區畜禽種場的保種群。同時，為了更準確的開展遺傳變異的檢測分析和缺失基因型的填補，揭示上海白豬的種質特性，本研究采用與其地理位置鄰近的中國地方品種(包括6個太湖流域地方品種：梅山豬、二花臉豬、楓涇豬、米豬、沙烏頭、嘉興黑豬)及西方引進品種(包括杜洛克、長白、大白、皮特蘭、巴克夏)作為對照品種，共計447個個體。

1.2 簡化基因組測序

上海白豬采樣個體基于Illumina公司Hiseq2000平臺，采用基因組簡化測序技術進行雙端測序[10-11]。為了更好的與其它品種進行比較，將上海白豬的測序結果與太湖豬和引進豬種11個品種測序結果[12-14]在一起進行SNP 和InDel calling，缺失基因型的填補則利用Beagle 4.1來完成[15-16]。最后，分別在全群和上海白豬群過濾掉最小等位基因頻率(MAF)小于0.05的SNP位點，用于后續分析。

1.3 基因功能區間分布

豬的基因注釋數據來自Ensembl數據庫(Ensembl release 78，ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-78/gtf/sus_scrofa/)[17-18]，共包含25 332個基因注釋信息。根據數據庫的信息，本研究主要將基因組區間分為起始或者終止密碼子、外顯子、內含子、非翻譯區(UTR)和基因間區。利用PERL腳本編程語言分析SNP、InDel是否在上述基因組功能區間。

1.4 基因功能富集分析

位于起始/終止密碼子區或者外顯子區的變異很有可能改變基因的結構和功能。因此，把位于起始/終止密碼子區或者外顯子區的變異定義為大效應突變。為了進一步了解各類大效應突變顯著參與的通路、生物學功能和參與的分子生物學過程，利用DAVID v6.7網絡數據庫工具及GO和KEGG數據庫[19-20]，對這些與大效應突變相關的基因，按突變類型分別進行功能注釋(GO annotation)和通路分析(Pathway analysis)。顯著性水平P閾值設定為0.05[21-22]。針對當前豬的GO與KEGG注釋庫還很不全面的問題，利用PERL腳本提取豬對應的人同源基因標識用于基因富集分析。

1.5 與QTL的映射

豬許多重要性狀的QTL已相繼被定位，并被收集到豬的QTL數據庫(http://www.animalgenome.org/, Release 32, Apr 27, 2017)[23-24]。截至本研究進行前，該數據庫共收集了12 618 QTLs，基于現有的QTL數據庫對SNP和InDel等遺傳變異進行功能注釋分析。針對有些QTLs長度過長，并不能有效地用于后續分析問題，本研究去除了長度超過1 Mb的QTLs，并且把重疊50%以上的兩個QTLs合并成一個新QTL，同時設定新QTL與其原始性狀都相關。此過程利用QTL的位置信息與性狀信息，通過Perl語言腳本處理完成。

2 結 果

2.1 上海白豬(上系)基因組堿基測序質量、覆蓋度和深度

經過污染序列的過濾之后，上海白豬共獲得大約430萬條高質量的reads，兩端堿基平均質量得分均在Q30以上，即堿基測得的正確率大于99.9%。其中，最小檢測個體和最大檢測個體測序reads數目分別為200萬條和616萬條，個體平均reads數目為409萬條(表1)。

測序覆蓋度是指每個個體測到的基因組總堿基數占該物種基因組總堿基數的百分比，由表1可知，每個群體個體的平均覆蓋度范圍從1.2%(楓涇)到3.98%(長白)，所有個體的平均測序覆蓋度為2.46%，上海白豬的平均測序覆蓋度為2.87%。測序深度是指基因組上的同一位置被測到的次數。測序深度的計算方法為每個個體測到的高質量reads數與唯一位置reads數的比值，在本研究中，上海白豬的平均測序深度為3.90，所有個體的平均測序深度為4.78倍，詳見表1。

2.2 上海白豬(上系)基因組變異檢測及在染色體上的分布

經SNP calling和過濾后，全群共檢測到487 323個SNPs、976 235個InDels。其中，上海白豬共檢測到328 586個SNPs、693 220個InDels(表2)。我們進一步統計了上海白豬各類變異在染色體上的數量和密度分布，發現序列的變異數量一般與染色體的長度相關，染色體長度越長其所含有的變異的數量越多。如表2所示，1號染色上的數量最多，SNPs和InDels分別為29 857和68 997個，而Y染色體上的數量最少，SNPs和InDels分別為39和100個。SNP和InDel在染色體上的平均密度分別為12.96/100 kb和26.67/100 kb。筆者進一步以400 kb為不重疊窗口，圖形化展示SNP的數量在染色體上分布，可見SNP和InDel的密度在不同染色體上的分布有較大的差異，同一染色體上，分布相對均勻，具體分布可見圖1和圖2。

2.3 上海白豬(上系)基因組SNP和InDel的功能區間分布

當前研究結果顯示，上海白豬SNP和InDel在基因內的數量分別為11 496和13 216個。基因上各類變異在每個染色體上的數量分布、對應的基因數量見表2。其次，按照基因的結構區域分類，我們進一步對各類變異做了統計分析。結果顯示，SNP和InDel在各類功能基因區間的分布特點基本一致。它們在不同的基因區間的數量分布詳見表3。由表3可知，絕大多數的SNP變異分布在基因間區，約占74.61%；內含子中比例次之，約為22.76%；外顯子區域中僅占1.67%。和SNP的分布規律一致，InDel在基因間區的比例也最高，約為83.38%，內含子中比例次之，約為14.98%。

表1 測序數據量、覆蓋度和深度Table 1 Distribution of high quality reads number, coverage and depth across population

表2 SNPs和InDels遺傳變異在染色體上的數量及其密度分布Table 2 The number and density distribution of SNPs and InDels detected on each chromosome

圖1 SNPs在染色體上的分布Fig.1 The location distribution of SNPs across genomes

圖2 InDels在染色體上的物理位置分布Fig.2 The location distribution of InDels across genome

2.4 上海白豬(上系)基因組SNP和InDel的功能注釋及通路分析

通過功能注釋及通路分析，分別鑒定出了上海白豬各類大效應突變對應的基因顯著參與的通路和生物學過程，結果見表4。SNP、InDel顯著參與的通路/生物過程數目分別為13和40個。大效應突變的基因富集分析結果顯示，不同類型變異富集的通路存在差異。SNP顯著參與的通路大部分是與蛋白高分子合成與調控有關。比如，蛋白代謝過程(GO:0019538)、高分子代謝過程(GO:0043170)等。而InDel多在組織、器官發育和疾病相關的通路中發生了富集，比如單細胞生物過程(GO:0044707)和致心律失常性右心室心肌病(ssc05412)等。綜上，本研究結果初步表明，不同類型的變異可能影響不同的基因網絡調控及生物功能。

表3 SNPs和InDels在不同的基因區間的數量分布Table 3 The number distribution of SNPs and InDels across genome region

表4 各類大效應變異顯著富集的GO和PathwayTable 4 Significant GO and Pathway enriched by the large-effect variants

(續表4 Continued)

(轉下頁Carried forward)

2.5 上海白豬(上系)基因組SNPs和InDels位于QTL的映射

經過過濾和合并之后，上海白豬SNPs和InDels在五大類QTLs注釋性狀中的數量分布詳見表5。坐落在不同性狀中的各類變異數量統計分析結果顯示，SNP變異主要分布在肉質與胴體性狀(256 573)和健康性狀(246 230)，外貌性狀中最少(205 204)；InDel變異在各個性狀中的分布規律與SNP基本一致，肉質與酮體性狀占比最多(283 936)，外貌性狀中最少(233 299)。

按照變異是否位于基因上，筆者又進一步開展了相關統計分析。結果顯示，SNP和InDel位于基因上的數量與變異對應的基因落在QTL區間上的比例基本一致，即主要分布在肉質與酮體性狀和健康性狀相關的基因上，而外貌性狀中最少。這表明，與肉質和健康相關的基因可能具有較高多態性，而與外貌性狀相關的基因可能相對比較保守，存在的變異較低。

表5 同時位于QTL與基因上的各類變異數量分布Table 5 The number distribution of variants located in both QTLs and gene regions

1. 位于QTLs中的變異數量；2.位于基因上的變異數量；3.與變異對應的基因數量
1.The number of variants located in QTLs;2. The number of variants located in the genes;3. The number of genes corresponding to the variants

3 討 論

SNP是一種重要的遺傳分子標記，也是當下分子遺傳學研究應用最為廣泛的分子標記。在本研究中，檢測到的328 586個SNPs中，有接近6%為新發現的SNPs，這表明在上海白豬中有著自己特異性，其基因組上仍然有大量的SNPs有待于被發現。通過測序技術發現，特色培育品種的遺傳變異對研究中國地方豬種和培育品種都非常必要。同時，對于豐富SNP數據庫也有著重要的意義。

除了進行SNP的檢測外，本研究還對上海白豬InDel變異進行了檢測，并發現這些變異廣泛存在于上海白豬的基因組中。這些結果將有利于人們對豬基因組信息更加全面和深入的認識。通過與已有研究比較[4,7, 12, 25]，本研究所檢測的InDels中，26.3%也被其它研究檢測到(若已報道的InDel與筆者檢測的重疊區域超過任一方長度的80%，則認為是同一個)。這些研究也從另一個側面證實了本研究檢測的可靠性。

在揭示上海白豬基因組遺傳分子的特征上，本研究主要對遺傳變異分子在染色體上的數量、密度、物理位置等分子特征進行了分析。研究結果表明，上海白豬的遺傳分子具有下列特征：第一，SNP在不同染色體上的密度分布存在差異。值得關注的是12號染色體，其變異的密度明顯高于其它染色體。筆者查看了Ensembl 的基因數據庫和QTLs數據庫，同樣發現12號染色體具有最高密度的基因分布，而且其QTL密度也在前3位。由此可以看出，12號染色體可能在基因網絡和性狀表現上發揮著非常重要的作用，值得研究者對此染色體重點關注。第二，除少量位置出現過密或過疏，變異在同一條染色體上的物理分布相對均一。因此，本研究檢測的SNP可以作為全基因組范圍內的遺傳標記，用于遺傳多樣性、群體結構、信號選擇、全因組關聯分析等研究中。

此外，研究發現，很多基因受到InDel改變閱讀框的影響。其中，一些基因與繁殖性狀相關，例如CXCL10基因，S.Dall′olio等[26]報道，CXCL10基因可能參與胚胎的發育和著床，該基因中存在的多態變異可以作為意大利大白豬產仔數關聯研究的標記。另外，一些基因是與免疫相關，如IRF7基因，IRF7基因屬于干擾素調控因子家族成員，在調節Ⅰ型干擾素抵抗病原體的感染中發揮著非常關鍵的作用[27-28]。而IFIT1基因同時作為傳遞和受體分子來抵抗幾類病毒家族病原體[29]。值得注意的是，基因富集分析結果也表明，InDel相關基因在多個與疾病相關的通路中發生了富集(如“ssc05414:Dilated cardiomyopathy” 和 “ssc05410:Hypertrophic cardiomyopathy (HCM)”)。因此推測，上海白豬的InDel極有可能在繁殖性狀與免疫性狀中發揮著重要作用。

QTL數據庫包含了豬經濟性狀的重要遺傳信息，因此對于動物遺傳研究學者是一個巨大的寶藏。為了更清楚地了解各類變異可能影響的性狀，建立遺傳變異與性狀之間可能存在的聯系，本研究開展了基于QTL數據庫的映射分析。同時又對各類變異在不同性狀中的分布特點進行了統計分析。結果顯示，各類變異在QTL上的比例分布與基因上的比例分布相近(除個別區間)，這表明各類變異在不同性狀QTL中基因上的分布相對均一。另外，本研究還統計了各類變異在新定義QTL中的密度，整體而言具有較高變異密度的QTL主要是與肉質與胴體及健康性狀相關，這些遺傳標記將能進一步用于解析為何上海白豬在肉質和抗病力上有較好表現。這些研究結果加深了人們對上海白豬基因組遺傳變異分布特點的了解，為進一步深入的研究其功能和加快分子育種進程奠定了基礎，也為其后續的保護和利用提供了分子生物學依據。

4 結 論

本研究利用簡化基因組測序技術對肉質好、胴體瘦肉率較高和耐粗飼的上海白豬(上系)全基因組范圍內的遺傳變異進行了檢測，并通過對太湖流域地方豬種和西方引進品種的合并比較分析，闡釋了這些遺傳變異的染色體分布、基因區間和功能注釋特征。本研究深入分析了上海白豬(上系)群體的遺傳現狀，為更好地進行提純復壯、分子設計育種與開發利用奠定基礎。

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