三黃種雞場孵化死胚中沙門菌的分離鑒定與耐藥性分析

徐耀輝，鄧同煒，齊亞如，韓文龍，盧建洲，蔣增海

(河南牧業經濟學院動物醫學院，鄭州450046)

禽沙門菌病是一類重要的禽傳染病，可以造成幼雛大量死亡、產蛋雞產蛋下降、種蛋孵化率、出雛率下降，弱雛率增加，該病具有水平傳播和垂直傳播的特性。該類病分為三種類型：雞白痢、禽傷寒、禽副傷寒，對應的病原分別為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌，以及雞白痢沙門菌與雞傷寒沙門菌之外的其他沙門菌[1]。其中雞白痢沙門菌和禽傷寒沙門菌有宿主特異性，主要感染禽類，而禽副傷寒沙門菌能廣泛感染各種動物和人，引起食物中毒。沙門菌的多重耐藥性問題也日益突出,既困擾著畜牧業的發展也威脅到了人類的公共衛生健康[2]。我國對禽沙門菌病非常重視，將其列為16種優先防治的動物疫病之一。《國家中長期動物疫病防治規劃(2012～2020年)》提出，2015年全國祖代以上種雞場的雞白痢沙門菌病達到凈化標準，2020年全國所有種雞場的雞白痢沙門菌病達到凈化標準。

三黃雞是我國最著名的土雞之一。從20世紀80年代開始，河南省鄭州地區新鄭市及其周邊地區發展為三黃雞北繁南養的集中區，并逐步轉為商品代三黃雞苗供應基地。2014年11月—2015年1月，選擇鄭州及許昌地區有代表性的四個父母代三黃種雞場，在其自帶孵化場采集孵化后期死胚樣品進行沙門菌的分離鑒定，并對其耐藥表型及相關耐藥基因進行檢測，以了解死亡雞胚中沙門菌的感染狀況，初步掌握雞胚源沙門菌的耐藥情況，為該病的綜合防控乃至凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和標準菌株

大腸桿菌ATCC25922，雞白痢標準株C79-13由揚州大學人獸共患病學江蘇省重點實驗室惠贈。2×TaqMaster Mix、DNA Marker DL2000均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；普通營養肉湯、營養瓊脂、SS瓊脂均購自北京奧博星有限責任公司；沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業有限公司；麥氏比濁管購自廣東環凱微生物科技有限公司；MH瓊脂購自英國Oxoid公司；所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 藥敏紙片

試驗用藥敏紙片卡那霉素(K，30 μg·片-1，CT0026B)、慶大霉素(CN，10 μg·片-1，CT0024B)、阿米卡星(AK，30 μg·片-1，CT0107B)，氨芐西林(AMP，10 μg·片-1，CT0003B)，阿莫西林-克拉維酸(AMC，30 μg·片-1，CT0223B)，頭孢他啶(CAZ，30 μg·片-1，CT0412B)、頭孢曲松(CRO，30 μg·片-1，CT0417B)、頭孢唑林(KZ，30 μg·片-1，CT0011B)，美羅培南(MEM，10 μg·片-1，CT0774B)、亞胺培南(IPM，10 μg·片-1，CT0455B)，氨曲南(ATM，30 μg·片-1，CT0264B)，四環素(TE，30 μg·片-1，CT0054B)、土霉素(OT，30 μg·片-1，CT0041B)，多黏菌素E(CT，10 μg·片-1，CT0017B)，氯霉素(C，30 μg·片-1，CT0013B)，恩諾沙星(ENR，5 μg·片-1，CT0639B)、環丙沙星(CIP，5 μg·片-1，CT0425B)，磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(19∶1)(SXT，25 μg·片-1，CT0052B)、磺胺異噁唑(SF，300 μg·片-1，CT0075B)，呋喃妥因(F，300 μg·片-1，CT0036B) 購自英國Oxoid公司；頭孢噻肟(CTX，30 μg·片-1，21027)、頭孢噻肟/克拉維酸(3∶1)(CTX/CA，30/10 μg·片-1，21092)、頭孢他啶(CAZ，30 μg·片-1，21028)、頭孢他啶/克拉維酸(3∶1) (CAZ/CA，30/10 μg·片-1，21091)均購自北京天壇藥物生物技術開發公司。

1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫療器械廠，恒溫空氣浴搖床購自賽默飛世爾科技有限公司，梯度PCR儀購自Biometra公司，凝膠電泳成像分析系統購自BIO-RAD公司。

1.4 樣品的采集

在河南省鄭州地區及許昌地區共選取4個父母代三黃種雞場(存欄量均在5萬套以上，標記為鄭州一場、鄭州二場、鄭州三場、許昌一場)，在其自帶孵化場隨機抽樣法采集同一批次孵化后期死胚樣品360份，除去破損、變質等不適于試驗的，剩余356份，采樣時確保采集的每枚死胚來源于不同個體的種雞，增加了樣品的代表性。

1.5 細菌的分離、鑒定與血清分型

將死胚體表消毒后無菌采集卵黃液按常規方法分離沙門菌。參考文獻[3]合成沙門菌腸毒素Stn基因引物，進行PCR初步鑒定，用全自動細菌鑒定系統進一步鑒定。采用玻片凝集法進行血清分型，根據Kauffmann-White抗原表[4]檢索沙門菌分離株的血清型。

1.6 藥敏試驗及ESBLs確證試驗

按照K-B法和美國臨床實驗室標準化協會(Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI)手冊[5]進行抗菌藥物的敏感性試驗和ESBLs陽性菌的篩選及確證試驗。以E.coli(ATCC25922)為質控菌株，試驗結果按照手冊[5]要求進行判讀。

1.7 耐藥基因的檢測

根據耐藥表型不同，擴增相應的37種耐藥基因。引物設計參考相關文獻，具體如下：超廣譜β-內酰胺酶類(Extended-Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)12種：TEM[6]、SHV[6]、CTX-M-1[6]、CTX-M-2[7]、CTX-M-3[8]、CTX-M-8[9]、CTX-M-9[10]、CTX-M-25[9]、OXA-1[8]、OXA-2[8]、OXA-10[8]、PSE[8]、氨基糖苷類10種：armA[11]、rmtA[11]、rmtB[11]、rmtC[11]、rmtD[11]、rmtE[11]、npmA[12]、aac(3)-IV[13]、aac6′-Ib[14]、aadA1-like[13]；頭孢菌素類6種：MOX[15]、CIT[15]、DHA[15]、ACC[15]、EBC[15]、FOX[15]；磺胺類3種：sul1[16]、sul2[16]、sul3[16]；四環素類6種：tetA[16]、tetG[16]、tetX[16]以及tetB、tetC、tetR，后三種引物序列自行設計，退火溫度均為55 ℃，序列如下，tetB正向引物 5′-AAATAACAGCAAACAGTAATGG-3′, 反向引物 5′-AAGTAGGGGTTGAGACGCAGCTA-3′，擴增片段長度493 bp；tetC正向引物 5′-TCTAACAATGCGCTCATCGT-3′，反向引物 5′-GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC-3′，擴增片段長度589 bp；tetR正向引物5′-AGGACGACGGTGCTTGCT-3′，反向引物 5′-ATGAGGACTGGCGGGTGT-3′，PCR擴增后隨機選取擴增產物進行測序和序列比較。

2 結 果

2.1 細菌分離鑒定

共分離到173株沙門菌，包括5種血清型，分別為雞白痢沙門菌(162株)、布利丹沙門菌(5株)、塞羅沙門菌(4株)、腸炎沙門菌(1株)，菲爾摩雷沙門菌(1株)。不同場沙門菌的分離率差異較大，詳見表1。

表1 不同來源死胚樣品沙門菌的分離結果Table 1 Isolation of Salmonella from different sources dead embryos

2.2 藥敏試驗

由表2可以看出，173株沙門菌總體上對磺胺異噁唑(82.1%)、氨芐西林(74.0%)、四環素(49.1%)、土霉素(48.6%)耐藥較嚴重。對于氨芐西林，鄭州一場(0)、鄭州二場(2.9%)分離菌株幾乎全為敏感，而鄭州三場分離的94株沙門菌耐藥率高達100%。對于四環素、土霉素，許昌一場分離菌株的耐藥率分別僅為5.1%和7.7%，遠低于其他3個場。經雙紙片協同法進行ESBLs初篩和確證試驗，有1株菲爾摩雷沙門菌(編號14-2)為ESBLs陽性。

由表3可知，呈現5重和6重耐藥的菌株各有1株，呈現4重耐藥的菌株有15株，有75株菌株(43.4%)呈現多重耐藥(耐三類或三類以上藥物)。其中耐藥譜為青霉素類-四環素類-磺胺類的菌株數量最多，有53株細菌。

2.3 耐藥基因的檢測

共檢測出13種耐藥基因。本次分離的1株ESBLs陽性菌株共檢測出TEM、CTX-M-3 2種耐藥基因；2株耐氨基糖苷類的菌株共檢出aac(3)-IV、aac6′-Ib、aadA1-like 3種耐藥基因；19株耐頭孢類的菌株共檢出MOX、ACC、DHA3種耐藥基因；143株耐磺胺類的菌株共檢出sul1、sul2、sul3 3種耐藥基因；84株耐四環素類的菌株共檢出tetA、tetR2種耐藥基因；耐藥基因檢出率詳見圖1。

本研究中五類抗菌藥物的耐藥表型和基因型的符合率均在72%以上，其中ESBLs類、氨基糖苷類、頭孢類的耐藥表型與基因型符合率為100%，詳見表4。

3 討 論

從356份三黃雞商品代死胚中分離到173株沙門菌，平均分離率為48.6%。鄭州一場分離率最低，為8.6%，鄭州二場、鄭州三場、許昌一場分離率分別為58.3%、79.7%、32.5%，比張莒等[17]報道的分離率(16.7%)和張麗芳等[18]報道的分離率(15.4%)高。由于本研究是以死胚而不是正常種蛋作為樣品，實際生產中攜帶沙門菌的種蛋比例應低于本結果。

僅從雞白痢沙門菌的分離情況比較，鄭州一場最低，為5.2%，鄭州二場、鄭州三場、許昌一場分別為55.0%、78.8%、27.5%。經了解，鄭州一場曾進行過雞白痢凈化，其他場則沒有凈化，表明檢疫凈化對雞白痢控制效果顯著。

本次調查以雞白痢沙門菌(93.6%，162/173)為優勢血清型。其他研究者報道[19-21](不顯示雞的品種)從河南省的發病雞采集病料或肉雞肛拭子和環境樣品分離沙門菌，以腸炎沙門菌為優勢血清型，與本研究結果不完全一致。分析可能是沙門菌血清型的分布與雞的種源、雞場環境、飼料、鼠類及其他媒介生物攜帶沙門菌等生物安全措施有關。本次分離到11株副傷寒沙門菌(6.36%，11/173)，副傷寒沙門菌能通過種雞群垂直傳播擴散，對雞群健康和食品安全帶來潛在威脅，需引起關注。

本次所分離的173株沙門菌對卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、呋喃妥因耐藥率較低，可能是生產中較少使用該類藥物所致。分離菌株對獸醫禁用的美羅培南、亞胺培南、氯霉素敏感，說明加強獸藥管理可以有效降低細菌的耐藥性。本次研究中磺胺異噁唑的耐藥率達到82.1%，而磺胺甲噁唑/甲氧芐啶耐藥率僅為8.1%，這可能反映出臨床上的藥物使用習慣，即在使用磺胺類藥物時一般都不使用增效劑[22]。氨芐西林極易產生耐藥性，四個場分離的菌株對氨芐西林耐藥率差異顯著；對于四環素、土霉素，鄭州一場、二場、三場分離菌株耐藥率遠高于許昌一場；本次所有分離菌株對氟喹諾酮類藥物恩諾沙星、環丙沙星均為敏感，與其他報道[22-24]不完全一致，可能與養殖場的用藥習慣有關。本次分離菌株對磺胺異噁唑、氨芐西林、四環素及土霉素耐藥率較高，這些藥物長期以來被廣泛用于我國的畜禽養殖中，藥物的選擇壓力使細菌產生了相當高的耐藥性，臨床上應減少使用。

本研究中耐四環素類的84株沙門菌共檢出tetA(71.4%)、tetR(15.5%)兩種耐藥基因，tetA檢出率與朱順等[22]的報道(72.55%)基本一致，與賴海梅等[25]的報道(40.54%)及廖成水等[26]的報道(7.55%)不一致。對耐磺胺類的143株沙門菌，sul1(9.1%)、sul2(81.1%)、sul3(51.8%)的檢出率與朱順等[22]的報道(60.78%，78.43%，35.29%)和廖成水等[26]的報道(58.7%，41.3%，21.74%)有所差異。表明在沙門菌對抗菌藥物產生耐藥性過程中不同耐藥基因的參與程度存在差異。本研究中沙門菌的耐藥基因與耐藥表型的符合率大于72%，表明耐藥基因廣泛存在于耐藥菌株中。另外，少部分具有耐藥表型的菌株沒有檢測到本文所列的耐藥基因，表明耐藥機制較為復雜，有待于進一步研究。

表2 173株沙門菌藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity test of 173 Salmonella strains

表3 173株沙門菌的耐藥譜Table 3 Drug resistance of 173 Salmonella isolates

圖1 13種耐藥基因的檢出情況Fig.1 Detection results of 13 resistance genes

表4 沙門菌耐藥基因型的分析結果Table 4 Results of Salmonella isolates antimicrobial resistant genotype

許多耐藥基因可在動物和人類病原菌間水平傳播。了解該地區流行株耐藥基因流行規律，對防控沙門菌病具有重要意義。

4 結 論

河南省三黃雞父母代群沙門菌的感染較為嚴重，以雞白痢沙門菌感染為主，也有少部分副傷寒沙門菌的感染。沙門菌多重耐藥嚴重，且耐藥基因普遍存在于耐藥菌株中。

參考文獻(References)：

[1] 陳溥言. 獸醫傳染病學[M]. 6版. 北京: 中國農業出版社, 2015.

CHEN P Y. Veterinary epidemiology[M]. 6th ed. Beijing: China Agriculture Press, 2015. (in Chinese)

[2] HUT J, JAWALE C, LEE J H. Antimicrobial resistance ofSalmonellaisolated from food animals: A review[J].FoodResInt, 2012, 45(2): 819-830.

[3] 劉蓓蓓. 沙門菌PCR檢測方法的建立及其初步應用[D]. 揚州: 揚州大學, 2009.

LIU B B. Development and preliminary application of a PCR assay for the detection ofSalmonellaspp.[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2009. (in Chinese)

[4] 朱 超, 許學斌. 沙門菌屬血清型診斷[M]. 上海: 同濟大學出版社, 2009.

ZHU C, XU X B. Serological diagnosis of Salmonella-species[M]. Shanghai: Tongji University Press, 2009. (in Chinese)

[5] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). M100-S25 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 25th informational supplement[S]. Wayne, PA: CLSI, 2015.

[7] DE OLIVEIRA GARCIA D, DOI Y, SZABO D, et al. Multiclonal outbreak ofKlebsiellapneumoniaeproducing extended-spectrum β-lactamase CTX-M-2 and novel variant CTX-M-59 in a neonatal intensive care unit in Brazil[J].AntimicrobAgentsChemother, 2008, 52(5): 1790-1793.

[9] ELLER C, SIMON S, MILLER T, et al. Presence of β-lactamases in Extended-spectrum-cephalosporin-resistantSalmonellaentericaof 30 different serovars in Germany 2005-11[J].JAntimicrobChemother, 2013, 68(9): 1978-1981.

[10] COQUE T M, OLIVER A, PéREZ-DAZ J C, et al. Genes encoding TEM-4, SHV-2, and CTX-M-10 Extended-Spectrum β-lactamases are carried by multipleKlebsiellapneumoniaeclones in a single hospital (Madrid, 1989 to 2000)[J].AntimicrobAgentsChemother, 2002, 46(2): 500-510.

[11] GRANIER S A, HIDALGO L, SAN MILLAN A, et al. ArmA methyltransferase in a monophasicSalmonellaenterica isolate from food[J].AntimicrobAgentsChemother, 2011, 55(11): 5262-5266.

[12] FRITSCHE T R, CASTANHEIRA M, MILLER G H, et al. Detection of methyltransferases conferring high-level resistance to aminoglycosides in enterobacteriaceae from Europe, North America, and Latin America[J].AntimicrobAgentsChemother, 2008, 52(5): 1843-1845.

[13] GUERRA B, JUNKER E, MIKO A, et al. Characterization and localization of drug resistance determinants in multidrug-Resistant, integron-carryingSalmonellaentericaserotype typhimurium strains[J].MicrobDrugResist, 2004, 10(2): 83-91.

[14] DE TORO M, ROJO-BEZARES B, VINUé L, et al.Invivoselection of aac(6′)-Ib-cr and mutations in the gyrA gene in a clinical qnrS1-positive Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104B strain recovered after fluoroquinolone treatment[J].JAntimicrobChemother, 2010, 65(9): 1945-1949.

[15] PéREZ-PéREZ F J, HANSON N D. Detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR[J].JClinMicrobiol, 2002, 40(6): 2153-2162.

[16] 孫 璐, 王 娟, 黃秀梅, 等. 肉雞屠宰生產鏈中的沙門氏菌耐藥基因檢測及耐藥相關性分析[J]. 中國動物檢疫, 2017, 34(1): 35-39, 42.

SUN L, WANG J, HUANG X M, et al. Drug-resistant gene detection of salmonella in broiler slaughtering production chain and correlation analysis on drug resistance[J].ChinaAnimalHealthInspection, 2017, 34(1): 35-39, 42. (in Chinese)

[17] 張 莒, 蒲 琪, 趙 瑾, 等. 藏雞和彭縣黃雞雞胚、弱雛中沙門氏菌的分離鑒定與耐藥性分析[J]. 四川農業大學學報, 2016, 34(3): 354-358.

ZHANG J, PU Q, ZHAO J, et al. Isolation and identification ofSalmonellaand analysis of antimicrobial susceptibility in chicken embryo and weak chicken from Tibet and Pengxian[J].JournalofSichuanAgriculturalUniversity, 2016, 34(3): 354-358. (in Chinese)

[18] 張麗芳, 肖 橋, 羅 薇. 成都某種禽場雞胚沙門氏菌的檢測[J]. 中國畜牧獸醫, 2015, 42(6): 1571-1579.

ZHANG L F, XIAO Q, LUO W. Detection ofSalmonellain chicken embryos in a breeding poultry field of Chengdu[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 2015, 42(6): 1571-1579. (in Chinese)

[19] 廖成水, 程相朝, 吳庭才, 等. 河南省雞源沙門菌新近流行株的分離鑒定及其耐藥性分析[J]. 中國家禽, 2010, 32(17): 31-35.

LIAO C S, CHENG X C, WU T C, et al. Isolation, identification and antimicrobial resistance analysis of recently isolates ofSalmonellafrom chickens in Henan[J].ChinaPoultry, 2010, 32(17): 31-35. (in Chinese)

[20] 崔 瑩, 李艷芬, 張秀麗, 等. 2013年河南省肉雞產業鏈中沙門菌污染狀況調查[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2014, 24(20): 3000-3003, 3009.

CUI Y, LI Y F, ZHANG X L, et al. A survey on salmonella contamination in meat chicken industry chain in Henan province in 2013[J].ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, 2014, 24(20): 3000-3003, 3009. (in Chinese)

[21] 白 莉, 張秀麗, 甘 辛, 等. 肉雞養殖場中環丙沙星和頭孢噻肟雙重耐藥沙門菌耐藥機制的研究[J]. 中國食品衛生雜志, 2015, 27(5): 487-494.

BAI L, ZHANG X L, GAN X, et al. Molecular characteristics of ciprofloxacin and cefotaxime co-resistant Salmonella isolates in broiler flocks[J].ChineseJournalofFoodHygiene, 2015, 27(5): 487-494. (in Chinese)

[22] 朱 順, 彭 忠, 王 帥, 等. 我國部分地區豬沙門菌的耐藥性[J]. 中國獸醫學報, 2017, 37(7): 1283-1287.

ZHU S, PENG Z, WANG S, et al. Antimicrobial resistance of pig originatedSalmonellaeisolates[J].ChineseJournalofVeterinaryScience, 2017, 37(7): 1283-1287. (in Chinese)

[23] 查 華, 石火英, 吉貞穎, 等. 2010～2012年蘇皖兩省雞白痢沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國家禽, 2013, 35(4): 17-20.

ZHA H, SHI H Y, JI Z Y, et al. Characterization and antimicrobial resistance analysis ofSalmonellapullorumisolates from Jiangsu and Anhui Province from 2010 to 2012[J].ChinaPoultry, 2013, 35(4): 17-20. (in Chinese)

[24] 査 華, 石火英, 尚 竟, 等. 江蘇安徽地區鵝源沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國獸醫雜志, 2014, 50(3): 63-65.

ZHA H, SHI H Y, SHANG J, et al. Characterization and antimicrobial resistance analysis of goose sourceSalmonellaisolates from Jiangsu and Anhui Province[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine, 2014, 50(3): 63-65. (in Chinese)

[25] 賴海梅, 鄒立扣, 劉書亮, 等. 肉雞屠宰生產鏈中沙門氏菌耐藥基因檢測與耐藥相關性分析[J]. 食品工業科技, 2015, 36(7): 187-191.

LAI H M, ZOU L K, LIU S L, et al. Drug resistance gene detection and the resistance correlation analysis in Salmonella isolated from broiler slaughterhouse production chain[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry, 2015, 36(7): 187-191. (in Chinese)

[26] 廖成水, 程相朝, 張春杰, 等. 雞源致病性沙門氏菌新近分離株的耐藥性與耐藥基因[J]. 中國獸醫科學, 2011, 41(7): 751-755.

LIAO C S, CHENG X C, ZHANG C J, et al. Antimicrobial resistance and resistance genes of pathogenicSalmonellarecently isolated from chicken[J].ChineseVeterinaryScience, 2011, 41(7): 751-755. (in Chinese)