屎腸球菌對大腸桿菌感染肉雞生長性能、血清生化指標和盲腸菌群結構的影響

曹廣添，代 兵，張玲玲，曾新福，楊彩梅*

(1. 浙江農林大學 動物科技學院，杭州 311300；2. 浙江惠嘉生物科技股份有限公司，安吉 313300)

大腸桿菌病(Colibacillosis)一直是家禽養殖的難題之一，其帶來腸道疾病的同時也造成了重大經濟損失[1]。在家禽生產中，使用抗生素是控制大腸桿菌感染最常用的方法[2]。然而，隨著抗生素在全球范圍內逐漸被取締，益生菌作為其替代物已被發現可以提高畜禽生長性能[3-4]，增強免疫功能[5-7]和調節腸道微生物區系[8]。

屎腸球菌(Enterococcusfaecium，簡稱E.faecium)，是腸道中常見的產乳酸的菌種，作為益生菌已廣泛應用于畜禽生產，美國飼料控制辦公室已將其列為研究對象[9-10]。研究發現，屎腸球菌可提高畜禽的生長性能，改善健康，使用對象主要包括豬[11]、牛[12]、肉雞[13-15]甚至魚類[16-17]等。M.Levkut等[18]發現，飼喂屎腸球菌EF55對沙門氏菌感染肉雞早期的免疫功能有調節作用。然而，很少有試驗報道屎腸球菌的飼喂對大腸桿菌感染肉雞的影響。

本研究以白羽肉雞為試驗動物，早期(7日齡)攻毒后，初步研究飼喂屎腸球菌對其生長性能、血清生化指標和盲腸菌群結構的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養

本試驗于浙江農林大學動物實驗基地(中國，杭州)選取1日齡健康狀況良好的白羽肉雞360羽(平均體重(49.4±1.4) g)，隨機分為4組，每組肉雞(公母各半)6個重復(每重復15只)，單籠飼養。試驗期間，肉雞自由采食和飲水。雞舍內溫度第一周維持在32 ℃，隨后逐漸減低至25 ℃。基礎日糧參考NRC(1994)相關營養指標配制(表1)。

試驗共持續4周，第一周結束后，陽性對照組、屎腸球菌組和抗生素組肉雞用一次性注射器口腔注射1 mL大腸桿菌菌液K88(108cfu·mL-1)。陰、陽性對照組肉雞采食基礎日糧，屎腸球菌組肉雞采食添加109cfu·kg-1屎腸球菌的基礎日糧，抗生素組肉雞采食添加10 mg·kg-1硫酸粘桿菌素的基礎日糧。

表1 基礎日糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal experimental diet (air-dry basis) %

預混料為每千克飼糧提供：VA 1 500 IU；VD3200 IU；VE 10 IU；VB23.5 mg；泛酸10 mg；煙酸30 mg；鈷胺素10 μg；氯化膽堿1 000 mg；生物素0.15 mg；葉酸0.5 mg；硫胺素1.5 mg；VB63.0 mg；鐵80 mg；鋅40 mg；錳60 mg；碘0.18 mg；銅8 mg；硒0.15 mg
Premix supplied per kilogram of diet: vitamin A (retinyl acetate) 1 500 IU; cholecalciferol 200 IU; vitamin E (DL-α-tocopheryl acetate) 10 IU; riboflavin 3.5 mg; pantothenic acid 10 mg; niacin 30 mg; cobalamin 10 μg; choline chloride 1 000 mg; biotin 0.15 mg; folic acid 0.5 mg; thiamine 1.5 mg; pyridoxine 3.0 mg; Fe 80 mg; Zn 40 mg; Mn 60 mg; I 0.18 mg; Cu 8 mg; Se 0.15 mg

1.2 菌種制備

屎腸球菌(HJEF005，雞腸道分離所得)及大腸桿菌K88制備參照文獻[19]的方法。

1.3 生長性能測定

在7、10、14、21和28日齡，肉雞每只進行稱重，用于計算其體重和平均日增重。

1.4 樣品收集

在試驗10、14、21和28天，每個重復隨機挑選體重相近的2只健康狀況良好的肉雞，采用靜脈割斷方法進行宰殺，促凝管收集血液后離心取血清，用以檢測血清生化指標。解剖并用無菌繩結扎盲腸后放入冰盒，其內容物在超凈工作臺內用EP管收集放入-80 ℃冰箱保存用以PCR-DGGE檢測。

1.5 血清生化指標測定

血清中免疫球蛋白IgA、IgE、IgM濃度利用ELISA試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司，武漢)檢測；補體C3、C4和溶菌酶濃度檢測使用南京建成試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)；操作步驟均參照說明書。

1.6 PCR-DGGE檢測

肉雞盲腸微生物菌群(16S rRNA的V3區)結構和多樣性用PCR-DGGE檢測。為減小樣本的多樣性，試驗將每組中12個盲腸樣品每4只合并為一個生物樣本進行后續試驗。微生物DNA提取采用Mobio試劑盒(Mo Bio, Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)，具體提取步驟參閱美國Mobio網站。PCR引物采用GC-338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和534R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。試驗采用50 μL反應體系：混合物包括10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1) 4 μL，引物338F(20 μmol·L-1) 1 μL，引物534R(20 μmol·L-1) 1 μL，模板DNA 2.5 ng，TaKaRa rTaq(5 U·μL-1) 0.25 μL，ddH2O補至50 μL。PCR擴增程序：初始溫度94℃10 min，30個循環(94 ℃ 60 s, 55 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用2%凝膠瓊脂進行鑒定。

DGGE分析中聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%，變性劑梯度為30%～60%(100%變性劑包括7 mol·L-1尿素和40%(v/v)離子甲酰胺)，電泳條件為140 V 450 min。染色采用銀染方法，用UMAX Power Look 1000透射掃描儀(Techville, Inc., Dallas, USA)掃描獲得的DGGE圖譜圖片。最終，利用BioEdit7.0 (Bio-Rad Canada, Mississauga, ON, Canada)、Phylip4.0及MEGA3.1軟件對結果進行分析。

1.7 統計分析

用SPSS 16.0軟件對試驗結果各處理進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，同時采用Duncan多重比較進行差異顯著性分析，以P<0.05為判斷差異顯著的標準。

2 結 果

2.1 屎腸球菌對感染大腸桿菌肉雞生長性能的影響

表2數據顯示，飼喂屎腸球菌改變了肉雞的生長性能。21、28日齡陰性對照組肉雞體重顯著高于陽性對照組(P<0.05)；14、21、28日齡屎腸球菌組肉雞體重顯著高于陰性和陽性對照組肉雞(P<0.05)；另外，大腸桿菌攻毒顯著降低了陽性對照組10～14、15～21 和22～28日齡肉雞的平均日增重(P<0.05)。另外，飼喂屎腸球菌顯著提高了攻毒肉雞10～28日齡的平均日增重(P<0.05)。

2.2 屎腸球菌對大腸桿菌感染肉雞血清免疫蛋白的影響

表3顯示了肉雞血清中免疫球蛋白的變化，10、21和28日齡陽性對照肉雞血清中IgA的濃度顯著高于陰性對照組肉雞(P<0.05)。在14和21日齡，與陰性和陽性對照肉雞相比，采食添加屎腸球菌和抗生素日糧顯著提高了肉雞血清中IgA的濃度(P<0.05)。整個試驗中，與陰性對照肉雞相比，屎腸球菌組和抗生素組顯著增加了肉雞血清中IgG的濃度(P<0.05)。與14和21日齡陽性對照肉雞相比，飼喂屎腸球菌顯著增加了血清中IgG的濃度(P<0.05)；與10和28日齡陰性對照肉雞相比，陽性對照組和屎腸球菌組肉雞血清中IgM濃度顯著增加(P<0.05)，而后兩者間無顯著性差異。以上結果說明，飼喂屎腸球菌可以顯著提高肉雞血清中免疫球蛋白的濃度。

2.3 屎腸球菌對大腸桿菌感染肉雞血清補體濃度的影響

表4顯示，在21日齡時，E. f組肉雞血清中補體C3的濃度顯著高于陽性對照組(0.263 mg·mL-1vs. 0.209 mg·mL-1,P=0.033)；另外，28日齡E. f組肉雞血清中補體C4的濃度顯著高于陰性對照和抗生素組(0.162 mg·mL-1vs. 0.122、0.118 mg·mL-1，P=0.01)。而且，飼喂屎腸球菌的肉雞較21和28日齡抗生素組，血清中C4濃度有了顯著提高(0.093 mg·mL-1vs. 0.069 mg·mL-1,P=0.019;0.162 mg·mL-1vs. 0.118 mg·mL-1,P=0.010)。以上結果表明，肉雞采食添加屎腸球菌日糧可以顯著提高大腸桿菌攻毒肉雞血清中補體的濃度。

表2 屎腸球菌對肉雞體重和平均日增重的影響Table 2 Effects of Enterococcus faecium on body weight and average daily gain in broilers

同行數據后所標字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下表同
Different letters in the same row means significant difference between treatments (P<0.05), the same letter in the same row means no significant difference between treatments (P>0.05). The same as below

表3 屎腸球菌對肉雞血清中免疫球蛋白的影響Table 3 Effects of Enterococcus faecium on the levels of serum immunoglobulins in broilers μg·mL-1

10到21日齡，陽性對照、抗生素組及屎腸球菌組肉雞與陰性對照組相比，血清中溶菌酶的濃度均有顯著增加(1.429、1.684、1.673 ng·mL-1vs. 1.216 ng·mL-1; 1.573、2.164、2.029 ng·mL-1vs. 1.269 ng·mL-1; 2.059、2.012、1.997 ng·mL-1vs. 1.548 ng·mL-1;P=0.001)。而且，10～14日齡抗生素和屎腸球菌組肉雞較陽性對照組肉雞，血清中溶菌酶濃度顯著增加(1.684、1.673 ng·mL-1vs. 1.429 ng·mL-1; 2.164、2.029 ng·mL-1vs. 1.573 ng·mL-1;P=0.001)。另外，試驗期間抗生素和屎腸球菌組肉雞血清中溶菌酶的濃度均沒有顯著不同。試驗結果表明，飼喂添加屎腸球菌的日糧可以顯著增加肉雞血清中溶菌酶的濃度。

表4 屎腸球菌對攻毒肉雞血清中補體和溶菌酶的影響Table 4 Effects of Enterococcus faecium on serum complement components and lysozyme in broilers

2.4 屎腸球菌對大腸桿菌感染肉雞盲腸微生物菌群的影響

表5和圖1顯示，28日齡攻毒肉雞盲腸微生物的多樣性指數。與陽性對照組相比，飼喂屎腸球菌顯著增加28日齡肉雞盲腸微生物菌群的香農指數。聚類分析顯示，屎腸球菌組肉雞盲腸微生物菌群穩定分布(圖2)。與陰性對照組相比，屎腸球菌組肉雞盲腸菌群有顯著變化。

表5 肉雞盲腸微生物菌群PCR-DGGE多樣性指數Table 5 Diversity index of cecal microflora community based on the PCR-DGGE DNA fingerprinting

NC、PC、Anti和E.f分別代表陰性對照組、陽性對照組、抗生素組和屎腸球菌組；NC 1、2、3分別代表陰性對照組3個肉雞盲腸生物樣本，PC、Anti和E.f同NC。下同NC represents negative control birds, PC represents positive control birds, E. f represents E. faecium-fed birds, Anti represents antibiotic-fed birds; NC 1, 2, 3 represent the cecal samples of birds in negative control group, which is same with PC, Anti and E.f. The same as below圖1 肉雞盲腸微生物16S rRNA V3區的PCR-DGGE圖Fig.1 PCR-DGGE DNA fingerprinting of the V3 region of 16S rRNA of cecal microbiota of broilers

AN、NC、PC、EF分別代表抗生素組、陰性對照組、陽性對照組和屎腸球菌組AN,NC,PC,EF represent the antibiotic-fed birds,negative control,positive control and E.faecium-fed birds groups,respectively圖2 肉雞盲腸微生物樣本PCR-DGGE聚類圖Fig. 2 Cluster analysis based on DGGE profiles from broiler cecal samples

3 討 論

3.1 飼喂屎腸球菌對大腸桿菌感染肉雞生長性能的影響

近年來，抗生素在家畜養殖方面的應用逐漸被取締，而其替代品則引起了研究者的興趣。我們都知道，大腸桿菌是禽類生長的慢性應激源[20]，且第一周往往是大腸桿菌感染的最脆弱時期[21]。本研究結果表明，與陰性對照相比，陽性對照組肉雞的體重和平均日增重顯著減少。M.E.Cook[22]發現，動物攻毒會減少營養物質進而影響生長性能，主要表現在防御過程中營養物質的吸收減少。K.Takahashi等[23]報道稱，注射免疫炎性因子(如LPS)不僅降低動物的免疫反應，同時也會導致生長的減慢。屎腸球菌已作為益生菌用以治療動物和人類腸炎疾病很長時間[24]。當前試驗顯示，飼喂屎腸球菌可以顯著提高大腸桿菌攻毒后肉雞的體重和平均日增重。A.B.M.R.Bostami等[25]研究顯示，肉雞采食添加含有屎腸球菌的益生菌，平均日增重和日采食量有顯著提高，且料重比顯著減低。K.C.Mountzouris等[4]認為，屎腸球菌顯著提高肉雞生長性能的作用機理是其對腸道形態的有益作用。此前的研究結果顯示，屎腸球菌對大腸桿菌感染的肉雞腸道形態的發育很有益，尤其是對絨毛高度和隱窩深度[19]。但P.A.Barrow[26]推測，腸道微生物和營養物質的互作也有可能是其促進機體生長發育的主要原因。A.Zheng等[27]則對采食了屎腸球菌肉雞的肝蛋白質組學進行了分析，認為其很有可能通過改變肉雞的營養物質分配來促進機體的最佳養分利用。

3.2 屎腸球菌對大腸桿菌感染肉雞血清生化指標的影響

研究發現，益生菌也可增加腸黏膜抗炎和促炎因子的濃度[13]。I.Ahmad[28]證實，益生菌可能通過增加抗體IgM和IgG的產生來提高機體的免疫功能。此前的試驗發現，飼喂屎腸球菌可以顯著提高早期肉雞回腸黏膜IL-4、TNF-α 和 S-IgA的濃度[19]。本試驗結果表明，與陽性和陰性對照組肉雞相比，屎腸球菌組肉雞顯著增加了血清中IgA濃度(14～28日齡)；另一方面，21日齡屎腸球菌組肉雞血清中C3濃度顯著高于陽性對照，28日齡C4濃度顯著高于陰性對照。以上結果表明，大腸桿菌K88或屎腸球菌促進了血清中IgA和IgG的分泌，與R.R.Kulkarni等[29]的研究結果相似。大量試驗結果也表明，益生菌可以促進肉雞機體的免疫反應[7,14, 30]。但K.C.Mountzouris等[6]發現，多種益生菌(包括腸球菌)的飼喂對肉雞血漿中免疫球蛋白的濃度沒有顯著作用。M.Levkut 等[18]試驗則發現，屎腸球菌EF 55對沙門氏菌攻毒肉雞的外周血中淋巴細胞亞群(CD4、CD8、CD4和IgM)數量沒有明顯的影響。還需后續試驗進一步探究屎腸球菌如何增加感染大腸桿菌肉雞血清中免疫蛋白的濃度。

3.3 屎腸球菌對大腸桿菌感染肉雞盲腸菌群結構的影響

本試驗發現，攻毒肉雞采食添加屎腸球菌日糧后，盲腸微生物的種類有顯著增加。J.W.Park等[31]發現，蛋雞飼喂屎腸球菌后，糞便中大腸桿菌的數量有顯著的減少；糞便中菌群的改變伴隨著體內營養物質吸收能力的提高和糞便中氨氣含量的降低。但M.M.Gheisar等[32]試驗結果卻顯示，采食添加屎腸球菌日糧的肉雞糞便中大腸桿菌和乳酸菌的數量沒有發生顯著變化。此前的試驗結果發現，屎腸球菌增加了肉雞盲腸中有益微生物乳酸菌和雙氣桿菌的數量，減少了大腸桿菌的數量，與其他試驗結果類似[10,19,33]。綜上所述，屎腸球菌是通過增加肉雞腸道中有益菌的種類，減少有害菌的數量來調節微生物菌群的種類和多樣性。

4 結 論

日糧中添加屎腸球菌提高了大腸桿菌感染肉雞的生長性能，提高了免疫相關指數，改善了盲腸內菌群結構的多樣性；肉雞飼喂屎腸球菌相較于抗生素組，整個試驗周期平均日增重顯著增加，試驗末血清中IgA濃度有顯著提高，盲腸中菌群的多樣性和豐度均有顯著增加。

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