黃體期不同營養水平對湖羊卵泡發育及相關葡萄糖代謝途徑的影響

聶海濤，黃欣愛，劉 浩，郭藝璇，王子玉，張艷麗，萬永杰，樊懿萱，張國敏，王 鋒*，王 潔*

(1.南京農業大學 江蘇省肉羊產業工程技術中心，南京210095；2.江蘇農牧科技職業學院，泰州 225300)

黃體期短期營養水平處理能夠顯著影響綿羊情期[1]，并推測卵泡內葡萄糖是影響卵母細胞質量和卵泡發育能力的主要因素之一[2]。體外培養液中添加生糖物質能夠顯著提高卵母細胞發育能力[3]。葡萄糖是顆粒細胞增殖分化最佳的能量底物，添加葡萄糖能夠增強顆粒細胞增殖和雌激素合成能力[4]。卵母細胞首先通過卵丘細胞的葡萄糖轉運蛋白(GLUT)系統吸收葡萄糖，再轉運至卵母細胞[5]。葡萄糖作為卵泡發育的重要能量來源，其在卵泡細胞內的代謝途徑主要包括多元醇途徑(Polyol pathway)、糖酵解途徑(Glycolysis pathway)、己糖胺生物合成途徑(Hexosamine biosynthesis pathway)和磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway)，上述途徑共同參與調節能量供應，細胞穩態，細胞核成熟等過程[6]。其中，糖酵解途徑是細胞糖代謝的主要能量供給途徑[7]，與卵母細胞發育能力正相關[8]，以丙酮酸和乳酸[9]或其他代謝中間產物的形式為卵泡發育直接[7]或間接[10]供能；糖酵解與卵母細胞發育能力正相關[8]。己糖胺代謝是主要的能量感應通路，其關鍵限速酶透明質酸合成酶 2(HAS2)的表達與卵母細胞發育能力密切相關[11]，透明質酸酶是胞外基質(ECM)基本骨架，而葡萄糖和葡萄糖胺是透明質酸酶合成的主要底物[6]，并進一步影響LH釋放波峰和表皮生長因子/FSH的分泌[12]，參與卵巢周期性排卵過程，并已被證明參與介導了卵泡內環境對營養水平的應答過程[13]。磷酸戊糖途徑為卵母細胞減數分裂各階段中核成熟和氧化還原反應提供了必要的底物來源[14]，并被認為其通過核質成熟調控參與卵泡發育過程[8]。多元醇途徑的增強被認為通過促進山梨醇和果糖的胞內累積等引發糖尿病[15]。葡萄糖途徑對卵丘卵母細胞生長和卵泡發育均具有重要的作用。此外，黃體溶解前補飼 4～6 d促進綿羊卵泡發育，限飼抑制卵泡發育。黃體期卵泡更易閉鎖，而顆粒細胞凋亡對卵泡閉鎖具有重要的作用。補飼期升高的葡萄糖直接作用于卵巢，增加黃體溶解時逃脫閉鎖的卵泡數，進而促進卵泡發育。然而，黃體期營養處理組試驗羊發情周期、卵巢組織不同直徑卵泡分布、卵巢組織細胞凋亡率；卵泡細胞GLUT蛋白及葡萄糖代謝途徑中部分關鍵基因表達量的變化關系至今未有報道。本研究以葡萄糖代謝途徑中部分基因為研究對象，探索其在不同營養條件下在卵泡細胞中的表達情況，并分析其與卵泡發育和卵巢組織凋亡的關系，有助于進一步探尋葡萄糖代謝在黃體期營養水平對綿羊卵泡發育的調控作用，豐富黃體期卵泡發育的“急性效應”分子機制，為科學飼養空懷母羊，提高綿羊繁殖力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗與2015年10月-12月在江蘇省泰州市海倫羊業有限公司開展，選擇體況良好，體重((43.69±1.27) kg)和月齡((29±4.5)月)相近的經產湖羊30只，預飼7 d后，使用孕酮海綿栓埋置法進行同期發情，12 d后下午撤栓并頸部皮下注射PGF2α(30 mg，寧波三生藥業有限公司)，次日清晨起使用經調教的成年公羊進行試情(06:00和18:00)，發情結束當日定義為下一個情期的第0 天，參照《肉羊飼養標準NY/T816-2004》中推薦的營養需要量標準，在隨后6 d對所有試驗羊按照1.0倍維持需要量水平(1.09 kg·d-1)飼喂全價顆粒飼料(TMR，表1)，在此情期的第7～14天，將所有試驗羊隨機分為1.0倍維持需要組(1.0M；1.09 kg·d-1)；0.5倍維持需要量組(0.5M；0.55 kg·d-1)，和1.5倍維持需要量組(1.5 M；1.65 kg·d-1)；第15天分別從3組隨機挑選屠宰6只試驗羊，并取卵巢組織待用，剩下的12只湖羊按1.0倍維持需要量詞喂, 并對原有各組試驗羊進行發情鑒定觀察，用以統計發情周期。試驗動物的飼養管理完全參照由南京農業大學動物福利倫理委員會制定的《實驗動物福利倫理指南(SYXK 2011-0036)》中的相關動物福利執行標準進行。

表1 TMR日糧組成及營養成分Table 1 Ingredient and chemical composition of the total mixed ration g·kg-1

1)預混料為每kg TMR日糧提供：維生素A 2 150 IU，維生素D 170 IU，維生素E 13 IU，Fe 56 mg，Cu 15 mg，Mn 30 mg，Zn 40 mg，I 1.5 mg，Se 0.2 mg，Co 0.25 mg，S 3.2 g，硫酸鈉10.1 g，其余為稀釋劑和載體物質(蒙脫石)
1)The premix provided the following per kg of the TMR diet: Vitamin A 2 150 IU, Vitamin D 170 IU, Vitamin E 13 IU, Fe 56 mg, Cu 15 mg, Mn 30 mg, Zn 40 mg, I 1.5 mg, Se 0.2 mg, Co 0.25 mg, S 3.2 g, Sodium sulfate 10.1 g, the remainder are diluents and carrier substances (montmorillonite)

1.2 卵巢組織處理

屠宰后摘取卵巢組織，用低溫生理鹽水沖洗3遍 以上，置于裝有冰預冷D-PBS的塑料培養皿中，隨機選取一側卵巢在體視鏡下使用眼科剪鑷鈍性剝除其結締組織，并根據方格紙柵格測量結果，分離直徑>1.0 mm的卵泡，放入含D-PBS的塑料培養皿中，剝離下的可視卵泡根據其卵泡直徑進一步分為<2.5 mm和≥2.5 mm卵泡兩個大小等級，隨后將剝離下的卵泡用眼科剪對半剖開，使用接種環沿卵泡內壁刮下卵泡細胞，連同卵泡液一同置于含紅細胞裂解液的預冷PBS中,孵育3～5 min，隨后將每只試驗羊同大小等級卵泡緩慢移入2 mL離心管中，4 ℃13 000 r·min-1離心10 min，-20 ℃保存待用。每頭羊卵泡液在30 min內分離完成，且在生物冰上操作。另一側卵巢組織經4%多聚甲醛固定后常規石蠟包埋, 4 μm切片待檢。

1.3 卵巢組織細胞凋亡檢測

使用原位細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：11684817910, 羅氏, 美國)進行檢測卵巢組織細胞凋亡情況。通過TUNEL法檢測細胞核染色的棕黃色為陽性細胞。經 TUNEL 染色及蘇木精復染后凋亡細胞核呈棕色，正常細胞核染藍色。結果根據凋亡陽性細胞分布情況，每張切片拍攝10個陽性視野，每視野記數30個卵泡細胞中陽性細胞數，以平均計算陽性細胞所占的百分比作為細胞凋亡率(Apoptosis rate，AR)，相應的結果表示為“平均值±標準誤(Mean±SE)”。

1.4 免疫組織化學檢測

將石蠟切片梯度脫蠟脫水，隨后抗原修復液在微波爐內高火煮沸，然后將切片放入其中，中低火修復10 min后，自然冷卻至室溫，3%甲醇-H2O2孵育20 min，以消除內源性過氧化氫酶的活性,蒸餾水沖洗, PBS浸洗5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15 min，分別滴加GLUT-4(博士德生物科技有限公司，武漢)蛋白多克隆抗體, 4 ℃孵育過夜(對照組用1% BSA代替)，用0.1% PBST洗滌，滴加二抗37 ℃孵育2 h，隨后使用0.05% DAB和0.01% H2O2混合顯色3 min(根據具體著色情況可適當縮短或延長顯色時間)，隨后對所有石蠟切片進行脫水透明處理并用中性樹脂封片，干燥后觀察。

1.5 Western blot檢測

用RIPA裂解法提取卵巢組織蛋白，并應用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度；根據所測濃度用RIPA裂解液調節蛋白濃度，保證各樣品的蛋白濃度一致，進行蛋白變性，變性后蛋白置于-20 ℃保存。將蛋白樣品使用上樣緩沖液進行稀釋(>1.5 μg·μL-1)，依據試劑盒說明書的要求分別進行分離膠和濃縮膠的制備，膠孔加樣20 μL的蛋白樣本，在聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(SDS-PAGE)中分別電泳30和120 min，剪取PVDF膜，在轉膜緩沖液中完成整個轉膜過程。將轉膜后的PVDF膜放入預先加入2 mL 5%的BSA的自封袋中，封口，置于搖床上，室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，加入2 mL GLUT4一抗(1∶750稀釋；貨號：21619；南京建成生物工程研究所)，封口，置于搖床上，4 ℃過夜孵育，TBST洗膜5次，放入新的自封袋中，加入2 mL稀釋好的二抗(1∶1 000，HRP標記的羊抗兔IgG)，置于搖床上，室溫孵育2 h。TBST洗膜5次后加入適量ECL顯影液，避光靜置2 min后，用Image Quant LAS 4000儀器進行顯影。

1.6 實時熒光定量分析

按照羅氏試劑盒說明，提取卵泡細胞總RNA，取2.5 μL RNA樣品，在微量分光光度計下測定樣本的OD值及總RNA濃度。以制備的cDNA為模板，利用設計合成的特異性引物(表2)，通過RT-PCR擴增目的基因，檢測卵巢組織中HAS2、AR、ECM1、G6PDH、GFPT1、GFPT2、HK1、OGT、PFK、SDHmRNA的表達，每個樣品設3個重復，β-actin為內參基因，基因的相對表達水平采用2-ΔΔCT方法進行分析。使用SPSS 18.0軟件進行單因素方差統計學分析，以P<0.05為差異顯著。反應體系：2 μL cDNA、10 μL SYBR green PCR master mix，6.8 μL 雙蒸水，上下游引物各0.6 μL，共計20 μL；反應程序：預變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個循環。

1.7 數據分析

數據使用SPSS16.0軟件進行統計分析，結果以“平均值±標準誤”表示，不同試驗組試驗羊的發情周期、卵巢組織凋亡率、卵泡細胞糖代謝相關基因表達水平和Western blot等數據采用One-way方差分析(Duncan’s 法多重比較)；不同大小卵泡數采用卡方分析(Fisher’s 精確檢驗)。

表2 熒光定量PCR引物信息Table 2 Information of quantitative PCR primer sequences

2 結 果

2.1 黃體期營養水平對發情周期及卵泡發育的影響

黃體期不同營養水平對試驗羊發情周期和不同直徑卵泡數量的影響見表3。0.5M組試驗羊的平均發情周期為(19.25±0.48)d，顯著高于1.0M組((17.75±0.63)d)和1.5M組((17.25±0.48)d；P<0.05)，該結果表明，黃體期0.5倍維持需要量飼喂水平顯著抑制了湖羊的發情。此外，營養水平處理顯著影響了卵巢組織大卵泡(卵泡直徑：≥ 2.5 mm)和小卵泡(卵泡直徑：1.0～2.5 mm)數量，其中0.5M組試驗羊大卵泡和小卵泡數量分別顯著低于和高于1.0M與1.5M組(P<0.05)；但3組試驗羊總卵泡數差異不顯著(卵泡直徑：≥ 1.0 mm)，此外，0.5M組試驗羊小卵泡數/總卵泡數、大卵泡/總卵泡數分別高于和低于1.0M與1.5M組(P<0.05)。

2.2 黃體期不同飼喂水平對卵巢組織細胞凋亡的影響

黃體期營養水平對卵巢組織細胞凋亡的影響如圖1所示；結果表明，0.5M組試驗羊卵巢組織顆粒細胞凋亡指數(29.50%±2.37%)顯著高于1.0M(11.11%±1.68%)與1.5M組(10.16%±1.82%；P<0.05)。

2.3 葡萄糖轉運蛋白在卵巢組織中的定位及其在卵泡細胞中的定量研究

葡萄糖轉運蛋白-4(GLUT4)在卵巢組織中的表達定位見圖2，如圖2所示，GLUT4蛋白主要在原始和初級卵泡(圖2A)、次級卵泡(圖2B)卵母細胞胞質中表達；在三級卵泡(圖2C)和排卵前卵泡(圖2D和E)顆粒細胞和膜細胞中均有表達。GLUT4在不同營養水平試驗羊卵巢組織<2.5 mm及≥2.5 mm卵泡中的表達變化情況如圖3所示，對0.5M和1.0M組而言，GLUT4蛋白表達量隨卵泡直徑的增加而顯著升高(P<0.05)，其在1.5M組不同直徑卵泡間差異不顯著(P>0.05)；且1.5M組<2.5 mm卵泡中GLUT4蛋白表達量顯著高于1.0M 和0.5M組(P<0.05)，但不同營養水平組在≥2.5 mm卵泡中GLUT4蛋白表達量差異不顯著(P>0.05)。

表3 黃體期不同營養水平飼喂試驗羊發情周期及卵巢組織不同大小卵泡數量情況Table 3 Estrous cycle and distribution of the ovarian follicles from ewes under different nutritional treatments during the luteal phase

同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)
The different small letters within the same row indicate significant difference (P<0.05)

A.不同營養水平處理試驗羊卵巢TUNEL檢測結果；B.卵巢細胞凋亡指數(▲.0.5M組；●.1.5M組；■.1.0M組)；*.P<0.05A.TUNEL results of ovarian from ewes among different nutritional treatments；B.Apoptosis index (▲. 0.5M group；●. 1.5M group; ■.1.0M group); *.P<0.05圖1 不同營養水平組湖羊卵巢細胞凋亡Fig.1 Cell apoptosis of ovarian in different nutrient treatments

A.初級卵泡；B.次級卵泡；C.三級卵泡；D.排卵前卵泡;F.D中長方形框標注所在區域的高倍視野下的排卵前卵泡；E.空白對照。EN. 卵母細胞巢；G.顆粒細胞；T.膜細胞A.The primordial follicle (pr) and primary follicle (pm); B. The secondary follicle; C.The tertiary follicle; D.The preovulatory follicle; F. The preovulatory follicle in the higher multiples of vision based on the frame marked area within the D; E.Blank control. EN. Egg nests; G.Granulosa cells; T.Thecal cells圖2 葡萄糖轉運蛋白(GLUT4)在卵巢組織中的定位(A、B、C、D和E 100×；F 200×)Fig.2 Immunohistochemical localization glucose transporter 4 (GLUT4) in ovarian tissues (A, B, C, D and E 100×；F 200×)

A.GLUT4在不同營養水平處理組試驗羊不同直徑卵泡細胞Western blot檢測結果；B.GLUT4蛋白表達量；*.相同卵泡直徑中不同營養水平處理組卵泡GLUT4表達差異顯著(P<0.05)；Φ.相同營養水平處理組中不同直徑卵泡GLUT4表達差異顯著(P<0.05)A.Western blot band of GLUT4 within different follicle size of ewes under different nutritional treatments; B.GLUT4 protein expression levels; *.Significant differences of GLUT4 expression between different nutrient levels within the same follicle size (P<0.05); Φ.Significant differences of GLUT4 expression between different follicle sizes within the same nutrient level (P<0.05)圖3 黃體期營養水平對卵泡細胞葡萄糖轉運蛋白(GLUT4)表達量的影響Fig.3 Effect of nutrient levels treatment during luteal phase on glucose transporter 4 (GLUT4) expression in follicular cells

2.4 糖代謝途徑關鍵基因在卵泡細胞中的表達情況

黃體期營養水平對不同直徑卵泡細胞糖代謝途徑關鍵基因表達量的影響如圖4所示：本研究中所檢測的卵泡細胞HAS2、ECM1、AR、GFPT1、HK1、OGT、PFK、SDH的基因表達量在<2.5 mm和≥2.5 mm卵泡細胞中的表達量在不同營養水平處理組間差異均不顯著(P>0.05)；己糖胺途徑關鍵酶GFPT2基因表達量在不同直徑卵泡中隨營養水平變化趨勢完全相反，表現為<2.5 mm卵泡中隨采食量水平升高而降低(P<0.05)，而其在≥2.5 mm卵泡中則隨采食量水平的升高而顯著升高(P<0.05)；此外，0.5M組≥2.5 mm卵泡細胞的戊糖磷酸途徑關鍵酶G6PDH基因顯著低于1.0M組和1.5M組(P<0.05)，而不同營養水平組G6PDH基因表達量在<2.5 mm卵泡中差異不顯著(P> 0.05)。

3 討 論

隨著細胞凋亡研究的深入，人們逐漸認識到次級卵泡的閉鎖主要是顆粒細胞的凋亡所致[16]。由細胞凋亡誘導的顆粒細胞死亡已在小鼠[17], 奶牛[18], 綿羊[19]和豬[20]等物種證實。 在哺乳動物黃體期卵泡發育過程中，僅有少數卵泡能夠逃脫閉鎖命運而發育至排卵。卵泡閉鎖最初表現為顆粒細胞出現核固縮，到了閉鎖后期，大量的顆粒細胞發生凋亡，顆粒細胞碎片充滿整個卵泡液。本研究結果表明，0.5M組試驗羊卵巢卵泡中細胞凋亡指數顯著高于1.0M和1.5M組，由此推測黃體期營養限飼對湖羊卵泡發育的影響與卵泡細胞凋亡有關。

葡萄糖是卵泡發育的能量和代謝底物來源[21]。機體攝入的葡萄糖需通過葡萄糖轉運家族蛋白(GLUTs)。其中，GLUT4被認為是具有胰島素依賴性、具有較強葡萄糖轉運能力的功能性蛋白[22]。本研究結果顯示，0.5M組試驗羊發情延遲，其在卵泡分級和不同直徑卵泡分布上表現為<2.5 mm卵泡數量的增多和≥2.5 mm卵泡數量的減少，提示0.5倍維持營養水平限飼可能抑制了<2.5 mm卵泡向≥2.5 mm卵泡的發育；結合GLUT4蛋白在不同營養水平和不同直徑卵泡細胞內的表達變化，筆者進一步猜測<2.5 mm卵泡發育的抑制很有可能與GLUT4在<2.5 mm卵泡細胞表達量的下調有關，同時已有研究表明黃體期低飼喂水平通過上調血液孕酮、雌二醇、孕酮與雌二醇比值和FSH水平抑制卵泡發育[23]，由此，筆者推測黃體期營養限飼對卵泡發育的抑制很可能與卵泡細胞的雌激素分泌能力差異有關。然而，不同營養水平組試驗羊≥2.5 mm 卵泡細胞GLUT4蛋白表達量無顯著差異，提示卵泡細胞葡萄糖轉運系統隨營養水平的表達變化模式存在卵泡發育階段依賴性，筆者認為在營養負平衡飼喂條件下，機體優先滿足優勢或亞優勢卵泡的葡萄糖需要，本研究所得卵泡細胞GLUT4蛋白隨卵泡直徑增加的上升的結果也為上述猜測提供了依據。

己糖胺合成通路(HBP)被認為能量狀態的“傳感器”[24]，6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-phosphate)經HBP途徑代謝為6-磷酸果糖(Fructose-6-phosphate)，并在谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉移酶(Glucosamine:fructose-6-phosphate transaminase；GFPT)的催化下進一步轉化為6-磷酸葡萄糖胺(Glucosamine-6-phosphate)，并最終生成細胞的重要糖基供體(UDP-N-乙酰葡糖胺)。HBP途徑在正常體細胞糖代謝總量中的占比僅為1%～3%，UDP-N-乙酰葡糖胺除作為糖基供體參與能量供給外，還能夠在透明質酸合酶(HAS)催化作用下生成的透明質酸(Hyaluronic acid)是卵丘細胞外基質(ECM)的主要骨架結構。已有研究發現，卵丘細胞中HAS表達量與卵母細胞發育能力的增強有直接關系[11]；此外，UDP-N-乙酰葡糖胺還能在O-連接糖基化酶(OGT)催化下發生O-聯糖基化，進而通過基因轉錄、信號轉導和細胞生長與分化等多個重要的生物學過程參與卵泡發育[25]。本研究中，OGT和HAS2基因在不同直徑卵泡和不同營養水平處理組表達量均無差異，表明黃體期營養水平處理并未影響卵泡細胞在O-聯糖基化和透明質酸合成過程。但作為HBP途徑的另一關鍵限速酶，GFPT2基因在≥2.5mm卵泡細胞中的表達量隨營養水平的升高而顯著升高，而<2.5mm卵泡中該基因隨營養水平的變化趨勢卻與之完全相反。由此推測，GFPTs基因表達量的變化趨勢反映了卵泡細胞的HBP途徑對營養水平應答在不同直徑卵泡間存在差異，且主要表現在6-磷酸葡萄糖胺和UDP-N-乙酰葡糖胺等反應中間產物催化效率的差異。GFPT抑制劑(6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸)能夠顯著降低卵丘細胞葡萄糖攝入量和增殖速率，該結果也佐證了本研究對HBP途徑可能參與調控卵泡發育的急性營養調節機制的推測。綿羊黃體期注射葡萄糖胺能夠顯著增加大卵泡數[26]，促進主動脈平滑肌IGFβ[27]以及骨骼肌TGFα基因表達[28]，通過抑制芳香化酶的表達[29]和雌二醇的分泌[30]參與調節卵泡發育，上述過程可能與本研究1.5M營養水平處理對試驗羊≥2.5mm卵泡發育的促進有關，進而表現為該組試驗羊≥2.5mm卵泡數量的增加。

*.相同卵泡直徑中不同營養水平處理組卵泡基因表達差異顯著(P<0.05)；Φ.相同營養水平處理組中不同直徑卵泡基因表達差異顯著(P<0.05)*.Significant differences of genes expression between different nutrient levels within the same follicle size (P<0.05);Φ.Significant differences of genes expression between different follicle sizes within the same nutrient level (P<0.05)圖4 黃體期營養水平對卵泡細胞糖代謝途徑關鍵基因表達的影響Fig.4 Effect of nutrient levels treatment during luteal phase on key genes involved in glucose metabolic pathway of follicular cells

磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway；PPP)是葡萄糖氧化分解的主要方式之一，由氧化和非氧化過程組成，所攝入的葡萄糖能夠以氧化和非氧化反應的形式參與到PPP中。作為磷酸戊糖途徑的第一限速酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)在卵母細胞和卵丘細胞中表達量有所不同，在牛上，卵母細胞G6PDH表達量顯著高于卵丘細胞[31]。本研究中，在1.0M和1.5M組中，G6PDH基因在≥2.5 mm卵泡細胞中的表達量顯著高于<2.5 mm卵泡細胞，這可能維持需要以上飼喂水平試驗羊卵巢組織中較大直徑卵泡中未成熟卵母細胞的質量提高、卵母細胞核成熟比例增加有關[32]，然而，0.5M組試驗羊G6PDH基因表達量在不同直徑卵泡細胞表達量卻無顯著差異，基于上述理論，筆者推測0.5M組不同直徑卵泡細胞在卵母細胞質量，核成熟比例上亦無顯著差異，也側面驗證前文中提及的營養限飼抑制了卵泡由<2.5 mm向≥2.5 mm進一步發育的推論。此外，作為PPP途徑的主要產物，NADPH作為還原劑、氫負離子的供體能夠將氧化型谷胱甘肽(GSSG)轉化為還原型谷胱甘肽(GSH)，從而發揮清除體內自由基維持氧化平衡的生物學功能[6]，因此，PPP途徑的增強對機體抗氧化應激能力具有正調控效應。本研究結果表明，0.5M限飼顯著降低了G6PDH基因在≥2.5 mm卵泡中的表達量，但其在<2.5 mm卵泡中的表達量無顯著差異，由此推測黃體期限飼特異性導致≥2.5 mm卵泡氧化應激的發生，與此類似，在利用3-硝基丙酸誘導氧化應激的在體小鼠模型中，與中等和小直徑卵泡相比，氧化應激誘導組大直徑卵泡閉鎖率更高，更易受到氧化應激的影響[33]。因此，筆者進一步推測PPP通路極有可能更傾向于在大直徑卵泡中發揮營養應答效應，且此效應很可能與氧化應激發生有關。

4 結 論

黃體期0.5M限飼導致湖羊發情延遲；此過程很可能與其卵巢細胞凋亡率的升高，<2.5mm卵泡細胞GLUT4蛋白表達量的降低和HBP途徑的增強，以及≥ 2.5 mm卵泡細胞中HBP途徑的減弱和PPP途徑的增強等有關。

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