LEPR及LEP基因表達量對FecB不同基因型小尾寒羊產羔數的影響

于嘉瑞，王翔宇，郭曉飛，賀小云，孫 慶，文禹粱，狄 冉，劉秋月，胡文萍，張效生，張金龍，孫 偉*，儲明星*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；3.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070；4.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381)

中國除小尾寒羊和湖羊等少數綿羊品種產多羔外，其余絕大部分綿羊品種均產單羔，這極大地制約了養羊業的發展。綿羊產羔數是由多個基因控制的復雜性狀，且遺傳力較低，通過傳統表型選擇很難獲得較大遺傳進展。因此，對影響綿羊產羔數相關基因進行研究，對于提高綿羊繁殖效率、加快綿羊育種進程、提高綿羊產業的經濟效益均非常重要。FecB基因是最早定位的控制綿羊產羔數的主效基因。20世紀80年代初期， G.H.Davis等[1]和L.R.Piper等[2]在對Booroola羊高繁殖力研究時發現，一個常染色體的突變位點顯著影響綿羊排卵數。1989年，該突變基因被綿、山羊遺傳命名委員會正式命名為FecB基因。2001年，3個研究團隊發現綿羊FecB的影響是由于骨形態發生蛋白受體1B(Bone morphogenetic protein receptor-IB，BMPR1B)基因編碼區發生了A746G突變，從而引起第249位氨基酸由谷氨酰胺變為精氨酸(Q249R)。FecB基因存在3種基因型，其中BB型羊產羔數>B+型>++型，BB型為突變型，++型為野生型[3-5]。隨著對產羔性狀研究的逐漸深入，多個控制綿羊產羔數的主效基因被陸續發現。GDF9、BMP15等TGFB超家族通路中的基因也是增加綿羊產羔數的主效基因[6]。對羅姆尼羊Davisdale品系的研究中發現，LEPR突變除了可以提早該品系羊的初情期，還影響綿羊的排卵數[7-9]，然而LEPR基因不是TGFB超家族通路中的成員。因此，該基因對排卵數的調控方式可能與以上影響排卵數的主效基因調控方式不同。

A.M.Ingalls等[10]通過研究一種近交繁殖的小鼠，發現其中一個基因的隱性突變可導致小鼠的肥胖，于是將該基因定名為肥胖基因(Obese，ob)。G.C.Kennedy[11]發現脂肪組織分泌某種調節體重的激素，稱為“飽感因子”。它能通過下丘腦調控中樞，調節機體攝食及能量消耗，保持體重相對平衡。直到1994年，Y.Y.Zhang 等[12]利用基因定位克隆技術成功克隆小鼠的ob基因，將其編碼蛋白定名為瘦素(Leptin)，之后就將ob基因表示為LEP。在20世紀90年代末期，K.P.Hummel 等[13]發現，在患有糖尿病的近交系小鼠中，鑒定了另外一個隱性肥胖突變基因(Diabetes，db)，表型與(ob/ob)小鼠相似。隨后，L.A.Tartaglia 等[14]證明，db基因是LEP的受體，并從小鼠脈絡叢中成功克隆LEPR。

在哺乳動物中，LEPR和LEP協同作用的leptin信號通路是維持機體能量平衡的關鍵因素。LEP作用于下丘腦的LEPR，提高交感神經的活性，使去甲腎上腺素的釋放增加，進而激活脂肪細胞膜上的β-3受體，使脂肪細胞內解偶聯蛋白的表達增加，于是能量轉化成熱能而釋放[15]。瘦素促進能量消耗的作用是通過提高促甲狀腺素的分泌而實現的[16]。

LEPR以及LEP影響機體神經內分泌功能，促進生殖系統功能和獲得并維持生殖能力[17]。在動物機體中，促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)由下丘腦分泌，刺激或抑制垂體促性腺激素的分泌。盡管在下丘腦促性腺激素釋放激素神經元尚未發現有LEPR表達，但是LEP可能通過通路刺激大鼠和豬的下丘腦進而釋放GnRH[18]。缺少功能性瘦素受體以及瘦素基因的小鼠不育并且發現生殖器官萎縮，經過體外注射瘦素治療，從而刺激GnRH，進一步刺激促卵泡素(FSH)、促黃體生成素(LH)和雌激素的釋放，不僅能夠恢復小鼠的生殖系統，還能促進萎縮的生殖器得到生長[19-21]。

瘦素及瘦素受體對卵泡發育及卵母細胞成熟有重要作用。在小鼠中，LEPR和LEP中任何一個基因的突變都可能造成leptin信號通路的失活，出現繁殖性能的下降，瘦素受體突變的小鼠卵巢在繁殖周期沒有成熟卵泡產生[22]。在小鼠的卵泡細胞和卵母細胞中均有瘦素受體的表達，且從初級卵泡～成熟卵泡這一生理過程中，LEPR的表達量呈現上升的趨勢，說明瘦素受體可能在卵泡發育過程中起到了較為重要的作用[23]。經過瘦素受體及瘦素處理的雌性大鼠，其卵巢功能的活性增強，伴隨著大量卵泡發育[24]。

綿羊產羔數是一個復雜性狀，在同一品種的高產綿羊中，可能會存在多個主效基因同時控制產羔數[25]。法國的Lacaune綿羊中有兩個主效基因BMP15和FecL同時控制產羔數[26]。小尾寒羊是中國著名的高繁殖力綿羊品種，FecB突變等位基因B在小尾寒羊中頻率較高，且與小尾寒羊的高產羔數相關聯[27]。小尾寒羊產羔數可能也受到除了FecB外其它基因的影響。本研究選取FecB野生型純合子和突變型純合子的小尾寒羊為研究對象，分別采集卵泡期的不同組織以及卵泡期和黃體期的下丘腦、垂體、卵巢3個性腺軸組織，采用實時熒光定量PCR方法檢測LEPR和LEP在各組織中以及不同時期性腺軸的表達特征，初步分析FecB突變后LEPR和LEP對小尾寒羊排卵數的影響，為進一步揭示小尾寒羊多羔的分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇山東省鄆城縣2～3歲健康小尾寒羊母羊21只，統計其當年的產羔數數據。然后在天津市畜牧獸醫研究所種羊場飼養，采用TaqMan法進行多羔主效基因FecB分型，其中BB型12只、++型9只。由于需要獲得小尾寒羊發情期的排卵數據，并采集黃體期和卵泡期多個組織樣品，所以對試驗羊進行兩次同期發情。第1次同期發情時，對空懷小尾寒羊放置陰道孕酮栓(CIDR)，同時注5 mL維生素AD用以保護小尾寒羊母羊陰道內膜。12 d后撤栓，撤栓當天記1 d，撤栓時刻記為0 h。撤栓后第7天使用腹腔鏡觀察排卵情況，并記錄排卵數。間隔14 d后，對羊群進行第2次同期發情，試驗方法與第1次同期發情相同，并在撤栓后45 h(卵泡期)和10 d(黃體期)屠宰，每組各3只(n=3)。屠宰后，立即取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、輸卵管、子宮體、垂體、下丘腦、卵巢11個組織樣品，用凍存管保存后迅速投入液氮速凍，帶回實驗室，-80 ℃保存備用。

1.2 組織總RNA的提取和檢測及cDNA第一鏈的合成

采用Trizol(Invitrogen，USA)和動物組織總RNA提取試劑盒(天根，北京)提取各組織總RNA，并用Nanodrop2000微量分光光度計(Nano Drop Technologies，USA)檢測提取RNA濃度，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(ChemiDocTMXRS+，BIO-RAD，USA)檢測RNA完整性。

利用反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit，TaKaRa，Japan)反轉錄合成cDNA，反轉錄體系為20 μL：PrimeScript RT Enzyme Mix 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer (for Real Time) 4.0 μL，RNA 1.0 μL，再用RNase-Free ddH2O將總體積補至20 μL。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA第一鏈。全程操作在冰上進行。將反轉錄產物進行5倍稀釋，用持家基因ACTB進行PCR檢測。將符合標準的cDNA置于-20 ℃保存，以用于檢測目的基因的表達。

1.3 熒光定量引物設計及目的基因表達量檢測

根據綿羊LEPR基因mRNA序列(GenBank登錄號：NM_001009763.1)信息，用Primer3.0在線軟件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設計引物，以核糖體蛋白L19基因(Ribosomal protein L19，RPL19)(其mRNA序列GenBank登錄號：XM_004012836.2)作為內參基因；對于綿羊LEP基因(GenBank登錄號：XM_004008038.3)，由于其只有3個外顯子，并且3個外顯子之間的距離較長，因此未能成功設計出用于SYBR Green定量PCR跨外顯子引物，且不進行其表達量與LEPR基因比較，所以LEP基因用了TaqMan探針法進行相對定量。利用TaqMan探針法并由泰興市宏潤吉康生物科技研究所合成TaqMan探針，配合此方法以綿羊肌動蛋白β基因(Actin beta，ACTB)(其mRNA序列GenBank登錄號：NM_001009784)作為內參基因。引物序列和產物大小以及用途見表1。LEPR采用SYBR Green染色法，嚴格按照TaKaRa熒光定量染料(SYBR?Premix ExTaqTMⅡ，TaKaRa，Japan)使用說明進行操作；LEP采用TaqMan探針法，按照Roche(LightCycler?480 Probes Master，Roche，USA)試劑使用說明書進行試驗。LEPR及LEP按照Roche LightCycler?480II熒光定量PCR儀使用說明書(Roche Light Cycler?480 II real-time PCR system，Roche，USA)進行熒光定量分析。

表1 綿羊4個基因的引物序列和產物大小Table 1 Primer sequence and product size of ovine 4 genes

1.3.1 TaqMan探針法 反應體系為20 μL，其中LightCycler?480 Probes Master 10 μL，上下游引物各0.8 μL，MGB探針0.5 μL，cDNA 模板濃度200 ng·μL-12.0 μL，ddH2O 5.9 μL。反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火10 s，40個循環；熔解曲線獲取10 min，降溫結束。

1.3.2 SYBR Green法 反應體系為20 μL，其中SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板濃度200 ng·μL-12.0 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR程序：95 ℃預變性5 s；95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；熔解曲線獲取10 min，降溫結束。

1.4 數據分析

數據用“平均數±標準誤”表示。對產羔數和排卵數進行不同基因型間t檢驗。對基因的表達量數據采用Excel(Microsoft Excel，USA)進行分析，利用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量[28]，使用SPSS Statistics 24(IBM，USA)軟件按照下述模型進行分析。

yij=μ+Gi+Tj+eij

其中，y為表達量；μ為平均數；G為基因型(BB型、++型)效應，i=1，2；T為卵巢的不同時期(卵泡期、黃體期)效應，j=1，2；e為隨機殘差效應。

2 結 果

2.1 不同FecB基因型小尾寒羊的排卵數和產羔數

對21只小尾寒羊進行同期發情，利用腹腔鏡觀察黃體，獲得不同FecB基因型小尾寒羊的排卵數，如表2所示。對++型9只小尾寒羊、BB型12只小尾寒羊的排卵數和產羔數進行t檢驗，發現BB型小尾寒羊的排卵數(P=0.003 5)和產羔數(P=0.004 0)均極顯著高于++型。

表2不同FecB基因型小尾寒羊排卵數和產羔數
Table2OvulationnumberandlittersizeofSmallTailHaneweswithdifferentFecBgenotypes

FecB基因型FecB genotype個體數Number排卵數Ovulation No.產羔數Litter size++91.67±0.707B1.04±0.14BBB124.15±1.144A2.89±0.73A

同列上標不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01),字母相同或未標注字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同
Different superscripts capital letters in the same column mean highly significant difference between groups (P<0.01) the same letter or without letter mean no significant difference between groups(P>0.05).The same as below

2.2 實時定量PCR的熔解曲線以及標準曲線

本研究以RPL19和ACTB為內參基因，LEPR和LEP為目的基因，各樣品的模板在反應后可獲得LEPR、LEP、RPL19、ACTB的標準曲線(圖略)，適用于2-ΔΔCt法計算，并得到單峰，且峰型銳利的熔解曲線(圖略)，說明引物特異性良好，符合熒光定量PCR數據分析的要求。

2.3 LEPR和LEP基因在卵泡期BB型小尾寒羊不同組織之間的表達模式

采用實時定量PCR檢測了LEPR和LEP在BB型小尾寒羊卵泡期各個組織中的表達量，對兩個基因在不同組織中表達量分布只進行了定性描述，而未進行顯著性檢驗，結果如圖1所示。LEPR在BB型小尾寒羊各個組織中均有表達，其中在下丘腦、心、肝中表達量較低，在卵巢、子宮體中表達量較高。LEP在小尾寒羊各個組織中也均有表達，其中在心、脾、肺、輸卵管、腎上腺中表達量較低，在下丘腦、垂體、卵巢性腺軸中表達量較高。

1～11.心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、輸卵管、子宮體、下丘腦、垂體和卵巢1-11.Heart,liver,spleen,lung,kidney,adrenal gland,fallopian tube,uterus,hypothalamus,pituitary and ovary圖1 LEPR(A)和LEP(B)在BB型小尾寒羊卵泡期各個組織中的表達Fig.1 Relative expression of LEPR(A) and LEP(B)genes in various tissues of Small Tail Han sheep with BB genotype in follicular phase

2.4 LEPR和LEP在小尾寒羊不同情期和FecB不同基因型中性腺軸的表達量

本試驗對不同情期(卵泡期和黃體期)、不同FecB基因型(BB型和++型)小尾寒羊的下丘腦-垂體-卵巢性腺軸組織進行了定量分析，結果如表3所示。LEP在不同情期、不同基因型的下丘腦、垂體、卵巢組織的表達都沒有顯著差異(P>0.05)。LEPR在不同情期、不同基因型的下丘腦和垂體組織中的表達都沒有顯著差異(P>0.05)。在卵巢中，卵泡期++型LEPR基因表達量高于黃體期++型，但差異不顯著(P>0.05)；卵泡期BB型LEPR基因表達量極顯著高于卵泡期++型(P=0.007)、黃體期BB型(P=0.003)和黃體期++型(P=0.003)。

3 討 論

本試驗使用實時熒光定量PCR技術檢測了LEPR及LEP基因在卵泡期小尾寒羊11個組織中的表達，分析發現，LEPR及LEP的表達具有廣泛性，但存在組織差異。其中LEP在下丘腦、垂體、卵巢呈現出極高的表達水平，而在心、脾、肺等組織中呈現較低的表達水平。劉寶鳳[29]研究發現，LEPR與LEP的表達水平呈負相關，LEP和LEPR存在著反向調控機制。所以也解釋了在本試驗中，當小尾寒羊處于同一情期時，LEP在腎上腺、輸卵管、子宮體組織中的表達較低，而LEPR在腎上腺、輸卵管、子宮體表達相對較高。下丘腦、垂體、卵巢組織中LEP和LEPR也存在著反向調控。在豬中實時熒光定量PCR結果顯示，LEPR在豬的22個組織中均有表達，并且相對豐度存在顯著差異(P<0.05)[30]。在這些組織中，子宮內膜附著部位的表達量相對豐度最大(P<0.01)，其次是下丘腦和大部分生殖組織(P<0.05)，垂體組織LEPR的表達相對豐度較低，本試驗結果與其相符。盧守亮等[31]檢測了LEPR在中國美利奴和多浪羊的下丘腦、卵巢、子宮性腺軸組織中的表達，發現LEPR在卵巢、子宮體、輸卵管組織中都有較高的表達。有研究表明，LEPR在貴州白山羊廣譜表達，繁殖系統表達較高[32]。本試驗結果同樣與其相符。在牛[33]、小鼠[34]中，LEPR在卵巢、子宮等繁殖相關組織中表達并影響牛、小鼠的繁殖性狀。

表3 LEP和LEPR在小尾寒羊下丘腦、垂體、卵巢中的表達量Table 3 Expression of LEP and LEPR genes in hypothalamus, pituitary, ovary of Small Tail Han sheep

本試驗對不同情期(卵泡期和黃體期)、不同FecB基因型(BB型和++型)小尾寒羊的下丘腦-垂體-卵巢性腺軸組織進行了定量分析。結果顯示，LEPR和LEP在下丘腦和垂體的表達在不同情期(卵泡期和黃體期)和不同FecB基因型之間都沒有顯著差異，推測LEPR及LEP發揮主要作用的組織不是下丘腦和垂體。但在卵巢中，兩種基因型卵泡期LEPR和LEP表達量都高于黃體期，卵泡期BB型LEPR表達量均極顯著高于卵泡期++型、黃體期BB型、黃體期++型。肥胖雌性小鼠經LEP治療后其卵巢重量增加，卵巢上的原始卵泡、初級卵母細胞、次級卵泡、成熟卵泡數目明顯增加，并觀察到卵巢的縱切面上總的卵泡數增加，提示LEP及LEPR在一定程度上提高了卵巢的生理功能[35]。鄧艷幔等[23]發現，在小鼠中，卵巢間質有LEPR蛋白表達，揭示LEP與LEPR結合，通過JAK-STAT通路對卵泡發育和成熟產生積極作用。N.Smolinska等[36]通過原位雜交和半定量PCR研究顯示，在豬的黃體和卵巢中均有LEPR的表達，卵泡期的LEPR和其蛋白質的表達增加，伴隨著黃體的退化而降低。有研究表明[37]，LEPR通過直接作用于卵巢和間接作用于中樞神經系統而參與對女性生殖功能的控制。在卵泡期對母羊禁食，導致LEPR濃度降低，也導致排卵率降低[38]。綜上表明，LEPR基因在卵巢上發揮了重要的生理功能。

4 結 論

小尾寒羊BB型的排卵數和產羔數都極顯著高于++型。LEPR基因在卵泡期小尾寒羊卵巢中表達量最高。卵泡期BB型小尾寒羊卵巢中LEPR表達量均極顯著高于卵泡期++型、黃體期BB型、黃體期++型。本研究結果表明，卵泡期LEPR基因高表達與小尾寒羊產羔數增加存在一定程度的正相關，為小尾寒羊產羔性狀選育提供了新的線索。

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