gga-miR-140-3p抑制馬立克病病毒轉化細胞MSB1增殖、遷移和侵襲

趙春芳，李 新，韓 博，曲魯江, 劉長軍, Jiuzhou Song, 連 玲*，楊 寧*

(1.中國農業大學動物科技學院，北京100193; 2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所禽傳染病研究室，哈爾濱150001；3. 馬里蘭大學帕克分校動物與禽類科學系, 馬里蘭州 20742, 美國)

馬立克病 (Marek’s disease, MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus, MDV)引起的惡性T淋巴細胞增生性腫瘤疾病；它是一種嚴重危害養雞業和家禽健康的傳染病[1]。MDV屬于馬立克病毒屬，又稱為禽皰疹病毒2型。體內感染MDV可以分為四個階段，分別為病毒溶細胞感染(感染病毒后的3至6 d)，潛伏感染(感染病毒后的7至10 d)，溶細胞感染第二階段(感染病毒后的10至14 d)和腫瘤轉化(感染病毒后的21 d)[2-3]。越來越多的微小RNA (microRNA, miRNA)在病毒引起的腫瘤性疾病中扮演重要角色，其中包括miRNA-181a[4]、miRNA-26a[5-6]、miRNA-219[7]等。

miRNA是小的單鏈非編碼RNA，長度約22個核苷酸，在調節細胞增殖、分化、凋亡、發育和腫瘤發生等生物過程中扮演重要角色[8]。miRNA通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(3′-untranslated region, 3′-UTR)結合影響轉錄或者mRNA的翻譯，從而在轉錄后水平上發揮作用[9]。現在，越來越多與MD腫瘤發生密切相關的宿主miRNA和病毒miRNA被挖掘出來。gga-miR-155只在MDV轉化的腫瘤細胞系中表達下調，這可以作為MD腫瘤細胞中特異性表達的標志[10]。MDV編碼的Mdv1-miR-M4-5p和gga-miR-155具有高度同源性，對MDV的原癌性具有至關重要的作用[11]；并且它能通過靶向潛伏轉化生長因子β結合蛋白1(Latent TGF-β binding protein 1, LTBP1)激活原癌基因c-Myc，從而抑制TGF-β信號通路[12]。Z.J.Li等[13]發現了79個感染MDV后表達呈顯著差異的miRNA，并發現兩類可以作為MDV感染和MD腫瘤發生指示標志的miRNA。gga-miR-26a在MDV引發的腫瘤中低表達[14]，在禽類轉化淋巴細胞系中介導白細胞介素2[5](interleukin-2, IL-2)和NIMA相關激酶6[6](NIMA related kinase 6, NEK6)的表達，并能抑制MD淋巴瘤細胞增殖。gga-miR-181a通過抑制類v-myb成髓細胞瘤病毒原癌基因同源體1(v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog-like 1, MYBL1)使MSB1細胞增殖發生抑制[15]。

我們利用Solexa深度測序分析了MD腫瘤組和非感染組的miRNA表達譜[16]，發現gga-miR-140-3p在MDV引發的腫瘤組織中表達異常。本研究檢測該miRNA對MD腫瘤細胞MSB1增殖、遷移的影響以及對與侵襲密切相關的MMP2、MMP9基因轉錄水平的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

試驗雞群和馬立克病毒毒株(MDV-GA)由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供。試驗選擇150只 無特定病原體(specific pathogen free, SPF)的白來航雞，分成2組，攻毒組100只，對照組50只。在1日齡時攻毒組個體腹腔注射MDV-GA(2 000 PFU)國際標準毒株0.2 mL。對照組注射同等劑量的無病毒稀釋液。兩組雞分開飼養在不同的負壓隔離器中，其他試驗條件一致，試驗全期56 d。MDV感染后30 d，剩余66只MDV感染雞和28只未感染對照組雞。在感染MDV的第30～56天，一共有47只雞形成腫瘤，另外19只雞狀態良好，未形成腫瘤。在感染后31～55 d，連續觀察雞群狀態，對外觀表現為嚴重病癥的個體進行屠宰，同時屠宰未感染對照組個體。個體屠宰后收集脾、肝和各組織來源的MD 淋巴瘤。所有組織保存在RNA保存液中用于RNA的提取。

1.2 細胞培養和miRNA轉染

MDV轉化淋巴細胞系，MDCC-MSB1，由C. Itakura博士友情饋贈，培養在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司)的RPMI-1640培養基中，放置于溫度37 ℃，相對濕度95%,含有5% CO2的培養箱中。FuGENE HD 轉染試劑(Promega公司)用于miRNA轉染，用于轉染的miRNA激動劑(agomir)和陰性對照(Negative control, NC)劑量分別為100 nmol·L-1。gga-miR-140-3p agomir和NC購自上海吉瑪公司。

1.3 RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

利用Trizol試劑(Invitrogen公司)按照說明書要求提取冰凍組織或細胞總RNA。利用cDNA synthesis kit (miRACLE公司)反轉錄miRNA; qPCR miRNA kit(miRACLE公司)用于miRNA定量檢測, 每組8個樣本。用于檢測內對照5S的上游引物序列為5′-ACCGGGTGCTGTAGGCTTAA-3′;檢測gga-miR-140-3p的上游引物序列為5′-AGGGTAGAACCACGGACAAAA-3′。反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，qRT-PCR反應在Invitrogen公司的ABI 7500儀器上進行40個循環。

利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (TransGen公司)將總RNA反轉為cDNA用于基因表達水平的檢測。使用Power SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogen公司)在ABI 7500儀器上進行qRT-PCR，每組三個生物學重復。引物信息如下：β-actin上游引物為5′-GAGAAATTGTGCGTGACATCA-3′，下游引物為5′-CCTGAACCTCTCATTGCCA-3′；MMP2上游引物為5′-TGAAACAGGAGATTTGGAT-3′，下游引物為5′-CATTTTGGCTTTCTTGGA-3′,MMP9上游引物為5′-ACCTGGACCGTGCCGTGAT-3′,下游引物為5′-TGCCTCGCCGCTGTAAAT-3′。基因的相對表達量以5S和β-actin為參考基因通過2-ΔΔCt方法表達為倍數變化。

1.4 細胞增殖檢測

在96孔板中接種95 μL細胞懸液(3×104·孔-1)，進行轉染。在轉染后的24、36、48、60和72 h利用CCK-8檢測細胞增殖。檢測時每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細胞培養箱內繼續孵育2 h，用分光光度計在450 nm測定吸光度。每組設置5個重復。

1.5 細胞遷移檢測

所有細胞培養試劑和Transwell chamber (8 mm孔徑; BD Bioscience公司)放在37 ℃溫育。在24孔板中接種500 μL細胞懸液(1.5×105·孔-1)，進行轉染。轉染48 h后，收集細胞，用PBS和無血清培養基先后洗滌一次，用無血清培養基懸浮細胞，計數。在Transwell下室加入600 μL含20%血清的培養基，上室加入100 μL細胞懸液，每孔5×104個細胞，繼續在培養箱培養16 h，收集下室的細胞進行計數。每組設置2個重復。

1.6 統計分析

2 結 果

2.1 gga-miR-140-3p在不同組織中的差異表達

gga-miR-140-3p在不同組織中的表達量見圖1。與非感染組脾相比，gga-miR-140-3p在腫瘤化脾中顯著下調(P<0.05)；與非感染組肝相比，gga-miR-140-3p在肝淋巴瘤中也呈現顯著低表達(P<0.05)(圖1)。結果表明該miRNA在MD腫瘤化組織中表達下調。

NS. 非感染脾；TS. 腫瘤化脾；NL. 非感染肝；LL. 肝淋巴瘤。n=8, *.P<0.05NS. Non-infected spleen; TS. Tumorous spleen; NL. Non-infected liver; LL. MD lymphoma from liver. n=8. *.P<0.05圖1 不同組織中gga-miR-140-3p表達水平Fig.1 Differential expression of gga-miR-140-3p in different tissues

2.2 gga-miR-140-3p對MD腫瘤細胞MSB1增殖的影響

過表達gga-miR-140-3p對MSB1細胞增殖影響的檢測結果見圖2。與對照組相比，轉染gga-miR-140-3p agomir后的24、36、48 h細胞吸光值顯著(P<0.05)降低，60和72 h吸光值極顯著(P<0.01)降低(圖2)。這表明該miRNA能顯著抑制MD腫瘤淋巴細胞增殖。

n=5，*.P<0.05，**.P<0.01圖2 gga-miR-140-3p對MSB1細胞增殖的影響Fig.2 Effect of gga-miR-140-3p on MSB1 cell proliferation

2.3 gga-miR-140-3p對MD腫瘤細胞MSB1遷移的影響

過表達gga-miR-140-3p對MSB1細胞遷移影響的檢測結果見圖3。與對照組相比，轉染gga-miR-140-3p agomir后，Transwell下室中的細胞數目顯著(P<0.05)較低(圖3)。這表明該miRNA能顯著抑制MSB1細胞遷移。

2.4 gga-miR-140-3p對MD腫瘤細胞MSB1侵襲的影響

過表達gga-miR-140-3p對MMP2、MMP9轉錄量影響的檢測結果見圖4。轉染gga-miR-140-3pagomir后，MMP2轉錄量在24 h顯著(P<0.05)降低，48和72 h極顯著(P<0.01)降低(圖4a)；MMP9轉錄量在48 h顯著(P<0.05)降低(圖4b)。這表明該miRNA能夠影響與侵襲相關基因的轉錄，從而可能影響MD腫瘤細胞侵襲。

n=2，*.P<0.05圖3 gga-miR-140-3p對MSB1細胞遷移的影響Fig.3 Effect of gga-miR-140-3p on MSB1 cell migration

n=3，*.P<0.05，**.P<0.01圖4 gga-miR-140-3p對MMP2和MMP9轉錄的影響Fig.4 Effect of gga-miR-140-3p on MMP2 and MMP9 mRNA expression level

3 討 論

作為一種短的非編碼RNA，miRNA參與腫瘤發生的報道日趨增多[17-21]。在前期試驗中，通過Solexa高通量測序發現gga-miR-140-3p在MDV引發的腫瘤化脾及肝淋巴瘤中表達異常[16]，提示該miRNA或許能夠作為MD腫瘤發生的生物標記。MDCC-MSB1細胞是一種由感染MDV BC-1毒株引發的脾淋巴瘤制備的細胞系，主要由CD4+T細胞組成，可以作為研究MD腫瘤轉化的細胞模型[22-23]。為揭示gga-miR-140-3p在MD腫瘤轉化過程中的作用，我們研究了它對腫瘤細胞MSB1功能的影響，結果表明該miRNA在一定程度上能夠影響MD腫瘤細胞增殖和遷移，同時能影響與侵襲密切相關基因的轉錄水平。

miR-140在多種癌癥中表達紊亂，通過靶向不同靶基因發揮各種各樣的作用。miR-140-3p在肺鱗狀細胞癌[24]、卵巢癌[25]、鱗狀上皮細胞癌[26]和基質細胞瘤[27]中表達下調，扮演腫瘤抑制因子的作用；然而在脊髓脊索瘤[28]中表達上調，扮演原癌miRNA的角色。F. Tian等[29]報道，與非感染組相比，感染MDV后gga-miR-140在MD易感系72脾中表達下調。L. Lian等[30]報道在感染MDV 14 d后，gga-miR-140-3p在感染脾中的表達量顯著降低，表明該miRNA表達異常在腫瘤轉化前期就已發生，腫瘤細胞在早期已經開始滲透入脾。我們的研究結果也顯示gga-miR-140-3p在MDV引發的腫瘤化脾中表達下調。在感染MDV的雞肌肉成纖維細胞(chicken embryo fibroblast, CEF)中，gga-miR-140-3p呈現高表達趨勢[31]；然而，我們發現gga-miR-140-3p在感染MDV的腫瘤化脾和肝淋巴瘤中表達比非感染組低。造成該miRNA表達差異的原因可能是因為CEF和脾、肝的細胞組成成分不一致，CEF主要是肌肉成纖維細胞，而脾和肝中含有大量的淋巴細胞。在骨肉瘤細胞U-2 OS和結腸癌細胞HCT116中，過表達miR-140能夠誘導p53和p21表達，同時伴隨細胞周期G1和G2期阻滯；進一步研究發現，該miRNA是通過靶向組蛋白去乙酰酶4(histone deacetylase 4, HDAC4)介導細胞周期進程[32]。在骨肉瘤細胞MG63中，過表達miR-140使細胞周期阻滯在G0/G1期，同時細胞遷移發生抑制[33]。過表達gga-miR-140-3p顯著抑制MSB1細胞增殖，提示該miRNA可能參與MD腫瘤細胞增殖。不過增殖發生抑制的原因是由細胞周期阻滯還是凋亡抑制引發還需要進一步研究。過表達miR-140-3p抑制肺癌細胞A549和H1299的增殖、遷移和侵襲[34]。在非小細胞肺癌裸鼠中，miR-140-3p靶向ATP酶磷脂運輸8A1(ATPase phospholipid transporting 8A1, ATP8A1)誘導凋亡從而抑制腫瘤細胞增殖，并且該miRNA抑制細胞遷移和侵襲[35]。遷移作為腫瘤轉化的重要特征之一，我們利用Transwell進行遷移試驗檢測過表達gga-miR-140-3p對MSB1遷移能力的影響。考慮到MSB1屬于懸浮細胞，細胞無法黏附在Transwell上室的膜上，而是會移動到下室的培養基中，所以我們采用細胞計數的方法來反映細胞遷移情況，過表達gga-miR-140-3p顯著抑制MSB1細胞遷移。金屬基質蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)能夠降解基底膜的主要組成成分——Ⅳ型膠原蛋白，參與腫瘤細胞侵襲和轉移，其中MMP2和MMP9是MMP家族的重要成員[36-39]。定量檢測MMP2和MMP9基因表達可以間接反映腫瘤細胞的侵襲能力。過表達gga-miR-140-3p抑制MMP2和MMP9的表達，提示該miRNA可能通過抑制細胞侵襲影響MD腫瘤轉化過程。

4 結 論

gga-miR-140-3p作為在MD腫瘤中異常表達的miRNA，能夠影響MD腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，提示該miRNA可能通過影響腫瘤細胞功能參與腫瘤轉化過程，該miRNA可以作為MD腫瘤發生的指示標志。

參考文獻(References)：

[1] BIGGS P M. The Leeuwenhoek Lecture,1997. Marek’s disease herpesvirus:oncogenesis and prevention[J].PhilosTransRSocLondBBiolSci, 1997, 352(1364):1951-1962.

[2] CALNEK B W. Marek’s disease-a model for herpesvirus oncology[J].CritRevMicrobiol, 1986, 12(4):293-320.

[3] CALNEK B W. Pathogenesis of Marek’s disease virus infection[J].CurrTopMicrobiolImmunol, 2001, 255:25-55.

[4] BHATTACHARYA S D, GARRISON J, GUO H T, et al. Micro-RNA-181a regulates osteopontin-dependent metastatic function in hepatocellular cancer cell lines[J].Surgery, 2010, 148(2):291-297.

[5] XU H T, YAO Y X,SMITH L P,et al.MicroRNA-26a-mediated regulation of interleukin-2 expression in transformed avian lymphocyte lines[J].CancerCellInt, 2010, 10:15.

[6] LI X, LIAN L, ZHANG D X, et al.gga-miR-26a targets NEK6 and suppresses Marek’s disease lymphoma cell proliferation[J].PoultSci, 2014, 93(5):1097-1105.

[7] FAVREAU A J, SATHYANARAYANA P. miR-590-5p,miR-219-5p,miR-15b and miR-628-5p are commonly regulated by IL-3,GM-CSF and G-CSF in acute myeloid leukemia[J].LeukRes, 2012, 36(3):334-341.

[8] BARTEL D P.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell, 2004, 116(2): 281-297.

[9] BRENNECKE J, STARK A, RUSSELL R B, et al. Principles of microRNA-target recognition[J].PLoSBiol, 2005, 3(3):e85.

[10] YAO Y X, ZHAO Y G,SMITH L P, et al. Differential expression of microRNAs in Marek’s disease virus-transformed T-lymphoma cell lines[J].JGenVirol, 2009, 90(Pt 7):1551-1559.

[11] ZHAO Y G,YAO Y X,XU H T,et al.A functional MicroRNA-155 ortholog encoded by the oncogenic Marek’s disease virus[J].JVirol, 2009, 83(1):489-492.

[12] CHI J Q, TENG M,YU Z H, et al. Marek′s disease virus-encoded analog of microRNA-155 activates the oncogene c-Myc by targeting LTBP1 and suppressing the TGF-β signaling pathway[J].Virology, 2015, 476:72-84.

[13] LI Z J,ZHANG Y P,LI Y,et al.Distinct expression pattern of miRNAs in Marek’s disease virus infected-chicken splenic tumors and non-tumorous spleen tissues[J].ResVetSci, 2014, 97(1):156-161.

[14] BURNSIDE J,OUYANG M,ANDERSON A, et al. Deep sequencing of chicken microRNAs[J].BMCGenomics, 2008, 9:185.

[15] LIAN L,LI X,ZHAO C F, et al. Chicken gga-miR-181a targets MYBL1 and shows an inhibitory effect on proliferation of Marek’s disease virus-transformed lymphoid cell line[J].PoultSci, 2015, 94(11):2616-2621.

[16] LIAN L, QU L J, CHEN Y M, et al. A systematic analysis of miRNA transcriptome in Marek’s disease virus-induced lymphoma reveals novel and differentially expressed miRNAs[J].PLoSOne, 2012, 7(11):e51003.

[17] LI X,LIAN L,ZHANG D X, et al.gga-miR-26a targets NEK6 and suppresses Marek’s disease lymphoma cell proliferation[J].PoultSci, 2014, 93(5):1097-1105.

[18] LIAN L,LI X,ZHAO C F,et al.Chicken gga-miR-181a targets MYBL1 and shows an inhibitory effect on proliferation of Marek’s disease virus-transformed lymphoid cell line[J].PoultSci, 2015, 94(11):2616-2621.

[19] HAN B, LIAN L, LI X, et al.Chicken gga-miR-130a targets HOXA3 and MDFIC and inhibits Marek’s disease lymphoma cell proliferation and migration[J].MolBiolRep, 2016, 43(7):667-676.

[20] ZHAO C F, LI X, HAN B, et al.Gga-miR-219b targeting BCL11B suppresses proliferation,migration and invasion of Marek’s disease tumor cell MSB1[J].SciRep, 2017, 7:4247.

[21] TIAN F, LUO J, ZHANG H M, et al. MiRNA expression signatures induced by Marek’s disease virus infection in chickens[J].Genomics, 2012, 99(3):152-159.

[22] AKIYAMA Y, KATO S. Two cell lines from lymphomas of Marek’s disease[J].BikenJ, 1974, 17(3):105-116.

[23] NAZERIAN K. An updated list of avian cell lines and transplantable tumours[J].AvianPathol, 1987, 16(3):527-544.

[24] TAN X G, QIN W Y, ZHANG L, et al. A 5-microRNA signature for lung squamous cell carcinoma diagnosis and hsa-miR-31 for prognosis[J].ClinCancerRes, 2011, 17(21):6802-6811.

[25] MILES G D, SEILER M, RODRIGUEZ L, et al. Identifying microRNA/mRNA dysregulations in ovarian cancer[J].BMCResNotes, 2012, 5:164.

[26] SAND M,SKRYGAN M,GEORGAS D, et al. Microarray analysis of microRNA expression in cutaneous squamous cell carcinoma[J].JDermatolSci, 2012, 68(3):119-126.

[27] SAND M,SKRYGAN M, SAND D, et al. Expression of microRNAs in basal cell carcinoma[J].BrJDermatol, 2012, 167(4):847-855.

[28] ZOU M X,HUANG W,WANG X B, et al. Identification of miR-140-3p as a marker associated with poor prognosis in spinal chordoma[J].IntJClinExpPathol, 2014, 7(8):4877-4885.

[29] TIAN F, LUO J, ZHANG H M, et al. MiRNA expression signatures induced by Marek’s disease virus infection in chickens[J].Genomics, 2012, 99(3):152-159.

[30] LIAN L, ZHANG D X, WANG Q, et al. The inhibitory effects of gga-miR-199-3p,gga-miR-140-3p,and gga-miR-221-5p in Marek’s disease tumorigenesis[J].PoultSci, 2015, 94(9):2131-2135.

[31] BURNSIDE J, OUYANG M, ANDERSON A, et al. Deep sequencing of chicken microRNAs[J].BMCGenomics, 2008, 9:185.

[32] SONG B, WANG Y, XI Y, et al. Mechanism of chemoresistance mediated by miR-140 in human osteosarcoma and colon cancer cells[J].Oncogene, 2009, 28(46):4065-4074.

[33] GU R,SUN Y F, WU M F, et al. Biological roles of microRNA-140 in tumor growth, migration, and metastasis of osteosarcomainvivoandinvitro[J].TumourBiol, 2016, 37(1):353-360.

[34] KONG X M, ZHANG G H, HUO Y K, et al. MicroRNA-140-3p inhibits proliferation, migration and invasion of lung cancer cells by targeting ATP6AP2[J].IntJClinExpPathol, 2015, 8(10):12845-12852.

[35] DONG W, YAO C P, TENG X P, et al. MiR-140-3p suppressed cell growth and invasion by downregulating the expression of ATP8A1 in non-small cell lung cancer[J].TumourBiol, 2016, 37(3):2973-2985.

[36] STETLER-STEVENSON W G, AZNAVOORIAN S,LIOTTA L A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis[J].AnnuRevCellBiol, 1993, 9(1):541-573.

[37] SUN J, HEMLER M E. Regulation of MMP-1 and MMP-2 production through CD147/extracellular matrix metalloproteinase inducer interactions[J].CancerRes, 2001, 61(5):2276-2281.

[38] LUO Y,LIANG F B,ZHANG Z Y.PRL1 promotes cell migration and invasion by increasing MMP2 and MMP9 expression through Src and ERK1/2 pathways[J].Biochemistry, 2009, 48(8):1838-1846.

[39] TABOURET E,BOUDOURESQUE F,FARINA P,et al.MMP2 and MMP9 as candidate biomarkers to monitor bevacizumab therapy in high-grade glioma[J].NeuroOncol, 2015, 17(8):1174-1176.