基于線粒體16S rRNA全序列分析我國綿羊癢螨兔亞種的遺傳多樣性
2018-06-07 07:44:23李燕芳趙習彬賴為民楊光友古小彬
畜牧獸醫學報 2018年5期
古 江，李燕芳，趙習彬，謝 躍，賴為民，楊光友，古小彬
(四川農業大學動物醫學院，成都 611130)
中國作為世界最大養兔出產國之一， 26個省(自治區、直轄市)家兔總出欄量5億2 000萬只，總存欄量2億2 400萬只(2015年兔產業體系數據統計)[1]；飼養的家兔種類包括肉兔、獺兔和毛兔，其中肉兔和獺兔存欄量和出欄量分別占全國的91.58%和99.80%[2]；2015年我國兔肉產量87.4萬t[1]，兔皮約1.1億多張，兔毛產量約2萬t[3]，兔皮、兔毛和兔肉總產量和出口量多年穩居世界第一。由此可見，養兔業在我國畜牧業經濟中占有舉足輕重的地位。
癢螨病是家兔養殖中常見的外寄生蟲病之一，據報道我國家兔感染率可達70.0%[4]。該病是由綿羊癢螨兔亞種(Psoroptesovisvar.cuniculi，又名兔癢螨)寄生于家兔的外耳道皮膚表面所引起，表現出瘙癢，撓耳，外耳道內卷紙樣結痂為主要臨床癥狀，造成家兔體重減輕、飼料轉化率下降、免疫功能降低，嚴重者出現死亡，給養兔業造成巨大的經濟損失[5-7]。物種的遺傳多樣性可受環境和地理隔離等因素影響而出現變異，這點已在日本血吸蟲[8]、捻轉血矛線蟲[9]、湖北釘螺[10]等物種中被證實。我國家兔飼養區域范圍廣泛、飼養品種較多，家兔品種和飼養區域的地理隔離是否會對家兔體表寄生的癢螨產生遺傳變異？相關研究目前仍十分缺乏。線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)具備母系遺傳和高突變等特征，常作為研究物種進化的遺傳標記[11-13]。我們課題組前期基于線粒體的編碼蛋白基因Cytb基因對我國綿羊癢螨兔亞種的遺傳變異進行了分析[14]，但因基因間存在不平衡的進化關系，僅選用一個線粒體基因進行遺傳變異分析并不能準確地反映種群間的進化[15]。因此，本研究中我們選取了線粒體基因中非編碼蛋白基因——16S rRNA基因再次分析我國家兔主要養殖區域的肉兔和獺兔體表寄生的綿羊癢螨兔亞種的遺傳多樣性特征，以期得到更為準確的我國綿羊癢螨兔亞種種群遺傳多樣性信息，從而為養兔業中癢螨病的防控提供基礎資料。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
從我國5個地理區域(華北、華東、華中、西北和西南)采集自然感染癢螨的肉兔和獺兔的外耳道結痂，從結痂中分離螨蟲經形態學鑒定為綿羊癢螨兔亞種[16]，于-20 ℃保存備用。其中分離自獺兔的癢螨樣品25個，分離自肉兔的癢螨樣品58個，共計83個樣品(表1)。
1.2 DNA的提取、PCR擴增和產物測序
將“1.1”中采集的各地癢螨樣品隨機挑選單個癢螨進行無菌研磨后，按照OMEGA公司的節肢動物DNA提取試劑盒(DNA Mollusc Kit)的說明書提取單個螨蟲的基因組DNA，提取的DNA保存于-20 ℃備用。根據GenBank上已發表的綿羊癢螨線粒體基因組序列 (登錄號：KJ957822)[12]設計特異性引物，擴增16S rRNA基因全序列。上游引物F-5′-AGGTATCGGAAGGTGCCTCT-3′；下游引物：R-5′-TCCCCTACCCCTAAAAGCTCA-3′。PCR擴增體系為25 μL：4 μL模板DNA，上、下引物各1 μL，6.5 μL ddH2O，12.5 μL 2 ×TaqPCR Master Mix。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。陰性對照模板使用無菌雙蒸水。PCR反應結束后，取5 μL PCR擴增產物進行1%的瓊脂凝膠電泳檢測目的片段的大小，隨后將PCR陽性產物送至生物工程(上海)股份有限公司進行正反雙向測序，以保證測序結果的準確性。
1.3 數據處理及分析
將測序結果按照峰圖人工核對，運用BLASTn和DNAMAN 6.0.3軟件對序列進行比對、拼接、剪切，構成對應的16S rRNA全序列文件。運用MEGA 5.0軟件對比核苷酸序列以及對堿基百分比和種群間遺傳距離進行分析；采用DnaSP 5.0軟件對變異位點數、單倍型數、遺傳分化系數(Fst)、核苷酸多樣性(Pi)和單倍型多樣性(Hd)進行統計，并計算基因流Nm=1/4(1/Fst-1)；采用Arlequin 3.1軟件分析種群間的遺傳差異(Fst)和分子變異(AMOVA)以了解不同地區的遺傳結構，并對各種群進行中性檢驗(Tajima’sD和Fu’sFs)；構建單倍型網絡分布圖和采用NJ法構建系統發育樹，并用bootstraps(重復1 000次)檢驗聚類樹的置信度。
2 結 果
2.1 核苷酸序列分析
成功獲得83個綿羊癢螨兔亞種樣品的16S rRNA全序列，經分析獲得的83條16S rRNA序列，全長均為1 025 bp(GenBank No.:MH 304762～MH 304844)。DnaSP 5.0軟件分析顯示83條基因序列中共有83個變異位點，其中包括68個單變異位點(81.93%)和15個簡約性位點(18.07%)，無堿基缺失和插入，其中轉換突變的數量大于顛換突變數量。
2.2 單倍型分布
83條序列共存在52個單倍型(H1～H52)，其中H2、H4、H9、H16、H32為共享單倍型；H4單倍型共享頻率最高。單倍型H2由華北地區的2個樣本(HB2與HB4)與西南地區的9個樣本所共享(XN2、XN8、XN12、XN31、XN33～35、XN42、XN43)；單倍型H4由華北地區(HB5)、華中地區(HZ1)、西北地區(XB1、XB6、XB7)、西南地區(XN10、XN43、XN44、XN45、XN46、XN47、XN48)共享；單倍型H9由華東地區(HD2、HD3、HD8)、西南地區(XN20、XN23、XN25、XN26)共享；單倍型H16由華中地區(HZ4、HZ6、HZ8、HZ9)、西南地區(XN19)共享；單倍型H32由XN21、XN22共享；其余的均是各種群地區特有的單倍型(表1)。
2.3 單倍型多樣性及核苷酸多樣性
5個地理種群的單倍型多樣性(Hd)為0.857 14(西北地區)～0.964 29(華北地區)，我國整體種群的單倍型多樣性(Hd)較高(0.958 27)，表明我國整體種群及各地種群的綿羊癢螨種群單倍型多樣性(Hd)較為豐富(表1)。我國整體種群的平均核苷酸多樣性(Pi)為0.006 86，而5個地理種群中，以華中地區的核苷酸多樣性(Pi)最低(0.001 71)，華東地區的核苷酸多樣性(Pi)最高(0.006 76)，表明我國這5個區域的核苷酸多樣性(Pi)較高；5個地理種群核苷酸差異指數(K)的范圍在1.755 56(華中地區)～6.928 57(華東地區)(表1)。
2.4 遺傳距離、中性檢驗值和遺傳分化指數
5個地理種群中，除華北地區的Tajima’sD檢驗值為正值(0.067 96)，其余4個地理種群均為負值(-1.658 34～-0.959 56)，西北地區Tajima’sD絕對值最高，華北地區Tajima’sD絕對值最低，并且華中地區、西北地區、西南地區種群差異顯著(P<0.005)。除華東地區的Fu’sFs值為正外(0.183 69)，其余4個區域值均為負(-20.424 13～-0.003 85)，以西南地區絕對值最高，西北地區絕對值最低，華中地區和西南地區種群差異顯著(P<0.005)(表1)。
華北地區與華東地區、華中地區、西北地區、西南地區的遺傳距離分別為0.008、0.005、0.005、0.007，且差異顯著(P<0.005)；華東地區與華中地區、西北地區、西南地區的遺傳距離分別為0.010、0.009、0.006，且差異顯著(P<0.005)；華中地區與西北地區、西南地區的遺傳距離分別為0.004和0.009，且差異顯著(P<0.005)；西北地區與西南地區的遺傳距離為0.008，遺傳距離差異顯著(P<0.005)(表2)。
5個地理種群間的Fst值(-0.037 59～0.587 63)和基因流值-6.900 7～31.117 62變化較大(表3)，其中華中地區與華東地區的Fst值最高，并且遺傳分化差異顯著(P<0.005)，這兩個區域的基因流Nm為0.175 43，表明種群間存在較小的基因流；華東地區與西南地區基因流值Nm(31.117 62)最高，表明種群間基因交流頻繁，導致兩者間的遺傳分化差異不顯著(Fst值=0.007 97，P>0.005)。
2.5 系統發育樹與單倍型網絡圖的構建
NJ樹顯示(圖1)，綿羊癢螨兔亞種的52個單倍型構成2個大的分支。2大分支包含了不同的地理來源及溫度帶的單倍型，單倍型的分布無規律可循，尚未形成顯著的地理種群結構和溫度種群結構。
單倍型網絡圖顯示(圖2)，單倍型被分成兩部分，各單倍型呈發散分布，相鄰單倍型之間的突變從1步到5步不等，網絡圖中各單倍型的聚類情況與NJ樹的聚類情況非常相似，同樣未形成顯著的地理種群結構。
3 討 論
本研究首次成功地利用PCR技術擴增了我國5大區域的83株綿羊癢螨兔亞種的16S rRNA全序列，并分析了其遺傳多樣性和種群結構特征。我們采用的單個癢螨蟲體進行DNA提取，克服了多個癢螨蟲體提取DNA所帶來的不準確性，避免了遺傳變異的不準確性[17-19]。研究表明地理環境和宿主的改變會影響寄生蟲種群遺傳結構[20]，前期我們課題組基于Cytb分析亦證實我國地理環境差異較大的各地采集的綿羊癢螨間存在較高的遺傳多樣性，有一定的遺傳分化，但未分化形成地理種群結構[14]。但基于單個基因得到的遺傳變異結果并不一定能準確地反映種群間的進化關系，因此，本研究采用線粒體16S rRNA基因進一步分析我國各地綿羊癢螨的遺傳多樣性。
環境的改變會導致動物物種自身變異的產生，遺傳變異的大小表現出其遺傳多樣性的高低，遺傳多樣性低的物種種群很難在多變的環境中生存。所以遺傳多樣性較高的物種比變異較低的物種更具備進化潛力和環境適應性，這更有利于種群的發展[21]。通常用單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)來衡量一個物種或群體遺傳多樣性。本研究中83個樣本共有52個單倍型，其Hd達0.958 27，表明我國這5個區域的綿羊癢螨的單倍型多樣性較為豐富。然而本研究中5個區域總的核苷酸多樣性為0.006 86，表現出較低的核苷酸多樣性水平。這種高Hd值、低Pi值的現象反映了綿羊癢螨種群在歷史中可能出現過瓶頸效應而出現種群擴張，種群快速的自身變異以致其較高單倍型多樣性，但并沒有積累較高的核苷酸多樣性水平[22]。這種高Hd、低Pi的現象常發現于大多數具有較大的母系有效種群和較強繁殖能力的無脊椎動物中[23-24]。再者，中性檢驗(Tajima’D和Fu’sFs)結果亦證明了我國綿羊癢螨群體在歷史上可能出現過種群擴張現象，從而易于該種群的生存。
表1 基于16S rRNA分析我國5個地理區域綿羊癢螨兔亞種種群的遺傳多樣性指數Table 1 Indexes of genetic diversity of Psoroptes ovis var. cuniculi populations from five regions in China, based on 16S rRNA
*.P<0.005，表示差異顯著
*.P<0.005, indicates significant difference
表2 我國5個地理區域綿羊癢螨兔亞種種群的遺傳距離Table 2 Genetic distance of Psoroptes ovis var. cuniculi populations between five region populations in China
表3 我國綿羊癢螨兔亞種種群的基因流(Nm)(上三角)和遺傳分化度(Fst)(下三角)Table 3 Gene flow (Nm) (above diagonal) and genetic diversity (Fst) (below diagonal) between Psoroptes ovis var. cuniculi populations in China
*.P<0.005，表示差異顯著
*.P<0.005, indicates significant difference
本次研究的5個地理區域跨越了亞熱帶和暖溫帶，同時被我國的南北分界線——秦嶺-淮河所隔離以及長江、黃河等河流的阻斷，這些天然的地理屏障形成了物種的地理隔離，地理的隔離可能會造成生殖隔離，因此天然的地理屏障形成了我國綿羊癢螨兔亞種種群之間的基因交流障礙。但從反映物種遺傳分化強弱的基因流(Nm)和遺傳分化系數(Fst)來看[25]，華東(山東)與西南(四川)種群間基因流值>4(Nm=31.117 62)，Fst值<0.05(Fst=0.007 97)，表明2個群體間基因交流充分，種群出現遺傳分化可能性小[25]；而華北與華東、西南以及華中與西北種群間亦存在一定的基因交流(Nm>1)，種群間遺傳分化較大(0.15
HB.華北；HD.華東；HZ.華中；XB.西北；XN.西南HB. Huabei；HD. Huadong；HZ. Huazhong；XB. Xibei；XN. Xi’nan圖1 基于癢螨16S rRNA的52個單倍型構建的NJ樹Fig.1 NJ Tree based on52 haplotypes of 16S rRNA of Psoroptes ovis var. cuniculi
單倍型的分布頻率與圓圈的大小成正比；不同顏色表示不同樣品來源The haplotype distribution frequency is proportional to the size of the circle; Different colors represent different sample sources圖2 基于16S rRNA構建的綿羊癢螨單倍型網絡圖Fig.2 A network map of Psoroptes ovis, based on 16S rRNA
系統發育樹(NJ樹)和單倍型網絡圖顯示我國綿羊癢螨16S rRNA單倍型構成2大分支，呈現出雜亂的分布格局，綿羊癢螨兔亞種蟲株并未按照地理來源聚集，同時亦未根據宿主(獺兔還是肉兔)而進行聚集，還未根據是源自亞熱帶還是暖溫帶而聚集(圖1和圖2)，未形成顯著的地理種群結構、溫度帶種群結構和兔品種種群結構。從遺傳距離、基因流及遺傳分化指數來看，處于亞熱帶的西南地區與處于溫帶的華東西區間基因流值較大，遺傳分化指數較小(表2和表3)。因此，我國綿羊癢螨種群間的基因交流與地理、兔品種和溫度帶無關。
4 結 論
本研究首次成功地利用PCR技術擴增了我國5大區域的83株單個綿羊癢螨兔亞種的線粒體16S rRNA全序列，分析了5個地理區域綿羊癢螨兔亞種的遺傳多樣性和種群結構特征。發現我國綿羊癢螨兔亞種的遺傳多樣性較高，遺傳分化不明顯，尚未形成地理種群結構。
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