重慶市部分養殖場金黃色葡萄球菌耐藥性分析及ESBL基因檢測

陳 瑤，丁紅雷，何 英，牟 豪，王立敏，王豪舉

(西南大學獸醫傳染病學實驗室，重慶 400715)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種重要的人畜共患病病原菌，廣泛存在于動物和人的呼吸道、消化道、體表等部位。金黃色葡萄球菌有多種感染途徑，不同感染途徑導致的臨床癥狀也不同。在獸醫臨床上常造成乳房炎、關節炎、臍炎、局部膿腫等疾病；也可引起人的皮膚化膿和敗血癥，其產生的腸毒素是造成人類食物中毒的一大元兇[1]。自1961年K. R. Eriksen[2]檢出第一株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)開始，關于金黃色葡萄球菌對各種抗菌藥物耐藥的報道越來越頻繁，至今已經發現耐環丙沙星、紅霉素、慶大霉素、四環素、萬古霉素等的耐藥菌株[3-4]，特別是多重耐藥現象越來越嚴重[5]，由此造成的一系列公共衛生問題已成為全世界關注的焦點之一。

超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是一種能夠水解青霉素，第一、第二、第三代和部分第四代頭孢菌素類抗生素和氨曲南，其活性又能夠被β-內酰胺酶抑制劑(如克拉維酸)抑制的酶類。多種ESBL基因編碼的蛋白均具有ESBLs活性。除TEM-12由染色體介導外，其余ESBL基因由質粒介導。目前世界各地發現的ESBL基因已經超過200種[6]。ESBL基因常常存在于革蘭陰性菌，如大腸桿菌和克雷伯菌，目前尚未見金黃色葡萄球菌攜帶ESBL基因的報道。

本研究分離了重慶市部分養殖場中的金黃色葡萄球菌，測定了其對多種藥物的耐藥性，并檢測了菌株中是否攜帶ESBL基因，為了解重慶市動物源性金黃色葡萄球菌的耐藥情況提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌菌株ATCC 25923和分離菌株由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 甘露醇氯化鈉培養基、Mueller-Hinton液體培養基購自杭州微生物試劑有限公司，溶菌酶購自BBI生命科學有限公司，溶葡菌素購自Biosharp公司，PrimeSTAR?Max DNA Polymerase購自寶生物工程(大連)有限公司，質粒提取試劑盒購自Omega公司。

1.1.3 藥敏試紙片 24種抗生素藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和處理

1.2.1.1 樣品采集: 所有樣品于2014.03-2017.12采集于重慶市的部分牛、雞、山羊、豬和兔養殖場。采集的所有樣品均置于有冰袋的泡沫箱中，6 h之內運回實驗室進行處理。共采集樣品1 371份。

1.2.1.2 樣品處理: 樣品經增菌后，將菌液或膿汁劃線接種于甘露醇氯化鈉平板，37 ℃培養20 h后置于4 ℃ 3～4 d。每個平板挑取3～5個淺黃色、黃色或橙色疑似金黃色葡萄球菌菌落劃線于LB平板，37 ℃培養20 h。挑取單個菌落，革蘭染色，觀察細菌形態。

1.2.2 臨床菌株的PCR檢測

1.2.2.1 引物設計與合成: 根據GenBank中公布的金黃色葡萄球菌nuc基因序列，用Primer Premier 5.0設計特異性引物nuc-F：5′-AGGGATGGCTATCAGTAATGTTTC-3′和nuc-R：5′-CATCAGCATAAATATACGCTAAGCCAC-3′。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

1.2.2.2 分離菌株的PCR鑒定：水煮法提取菌液DNA，隨后進行PCR擴增。反應體系：2×TaqMaster Mix 10 μL，nuc-F(10 μmol·L-1)0.5 μL，nuc-R(10 μmol·L-1)0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，總反應體系20 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸6 min。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果。以金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為陽性對照。

1.2.3 藥物敏感性試驗 根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗標準，采用K-B紙片法對金黃色葡萄球菌臨床分離株進行藥物敏感性試驗。以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質控菌株。

1.2.4 金黃色葡萄球菌ESBL基因檢測

1.2.4.1 質粒的提取：取4 mL菌液，12 000 r·min-1室溫離心1 min，棄上清，加入250 μL solution Ⅰ重懸后加入終質量濃度為5 μg·mL-1的溶葡菌素和10 μg·mL-1的溶菌酶，37 ℃反應至液體澄清后，按照試劑盒說明書提取質粒。

1.2.4.2 ESBL基因的PCR擴增：以提取的質粒為模板，使用PrimeSTAR?Max DNA Polymerase PCR擴增8個ESBL基因，包括blaTEM[7]F-5′-TCCGCTCATGAGACAATAACC-3′, R-5′-TTGGTCTGACAGTTACCAATGC-3′，退火溫度55 ℃、blaCTX-M[7]F-5′-TCTTCCAGAATAAGGAATCCC-3′，R-5′-CCGT-TTCCGCTATTACAAAC-3′，退火溫度50 ℃、blaSHV[8]F-5′-TGGTTATGCGTTATATTCGCC-3′，R-5′-GGTTA-GCGTTGCCAGTGCT-3′，退火溫度61 ℃、blaOXA-2[9]F-5′-AAGAAACGCTACTCGCCTGC-3′，R-5′-CCAC-TCAACCCATCCTACCC-3′，退火溫度58 ℃、blaOXA-10[10]F-5′-GTCTTTCGAGTACGGCATTA-3′，R-5′-ATTTTCTTAGCGGCAACTTAC-3′，退火溫度53 ℃、blaVEB[11]F-5′-GATAGGAGTACAGACATA-TG-3′，R-5′-TTTATTCAAATAGTAATTCCACG-3′，退火溫度47 ℃、blaPER[12]F-5′-ATGAATGTCATCACAAAATG-3′，R-5′-TCAATCCGGACTCACT-3′，退火溫度49 ℃和blaGES[13]F-5′-ATGCGCTTCATTCACGCAC-3′，R-5′-CTATTTGTCCGTGCTCAGG-3′，退火溫度55 ℃，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。擴增的PCR產物送北京六合華大基因科技有限公司測序，測序結果經BLAST比對后進行基因分型。

2 結 果

2.1 菌株分離

本研究在1 371份樣品中，通過選擇性培養基的培養和增菌，并通過PCR鑒定共分離到金黃色葡萄球菌89株(圖1)，分離率為6.5%(表1)。其中在牛、豬、雞、羊和兔場各分離到6株(1.7%)、25株(7.3%)、32株(6.7%)、10株(11.4%)、16株(15.2%)菌株。兔場的分離率最高，其次為羊場、豬場、雞場，奶牛場的分離率最低。

M. 相對分子質量標準marker Ⅲ；1. ATCC25923；2～23. 臨床分離菌株；24. ddH2OM. Marker Ⅲ; 1. ATCC25923; 2-23. Isolates; 24. ddH2O圖1 金黃色葡萄球菌特異性nuc基因的檢測Fig.1 Detection of S. aureus specific nuc gene

表1 金黃色葡萄球菌菌株分離鑒定情況Table 1 Isolation and identification of S. aureus strains from different animals

2.2 藥物敏感性

89株金黃色葡萄球菌臨床分離株對24種抗菌藥物的敏感性結果見表2。分離菌株對青霉素類藥物耐藥最為嚴重，其次為四環素類、大環內酯類和喹諾酮類。

從菌株來源來看，豬源和雞源菌株的耐藥情況較羊源、牛源和兔源菌株嚴重。

表2 金黃色葡萄球菌臨床分離株的藥物敏感性Table 2 Antimicrobial susceptibility of S. aureus isolates

(轉下頁Carried forward)

(續表2 Continued)

R/S/I.耐藥/敏感/中介
R/S/I.Resistant/Sensitive/Intermediate;DRR. Drug-resistant rate

由圖2可見，不同動物來源菌株和同一動物來源不同菌株對所測定藥物的耐藥數量不同。最高的1株豬源菌株耐21種藥物，最低的2株兔源菌株耐1種藥物，耐15種及以上藥物的菌株有15株，占總菌株數的16.8%。豬源菌株中耐16種及以上藥物的有12株，占豬源菌株數的48%。雞源菌株的耐藥數為2～18種不等；牛源菌株有5株耐5種及以下藥物，1株菌耐11種藥物；羊源菌株的耐藥數為2～10種不等；兔源菌株耐藥數為2～9種不等。

2.3 ESBL基因檢測及分型

通過對blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaOXA-2、blaOXA-10、blaVEB、blaPER和blaGES8個ESBL基因的PCR檢測發現，只有blaTEM基因能被擴增出來(圖3)，該基因存在于86株臨床分離菌株，占所有分離菌株的96.6%。通過BLAST序列比對分析，所有86個blaTEM基因均為TEM-1a基因型。

圖2 金黃色葡萄球菌臨床分離株的多重耐藥情況Fig.2 The number of multidrug-resistance S. aureus isolates

M. 相對分子質量標準marker Ⅲ；1～24. 臨床分離菌株M. Marker Ⅲ; 1-24. Clinical isolates圖3 blaTEM基因PCR擴增Fig.3 Amplification of blaTEM gene by PCR

3 討 論

金黃色葡萄球菌是自然界、人和動物的體表、消化道、呼吸道廣泛存在的細菌，當機體抵抗力降低、環境條件惡劣、體表或外科手術創面暴露時，金黃色葡萄球菌可乘機感染這些部位。由于金黃色葡萄球菌可能造成廣泛的感染，在人和獸醫臨床上通常使用抗菌藥物來預防和治療金黃色葡萄球菌感染，這也造成了金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的廣泛耐藥，如對β-內酰胺類、氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類等耐藥，特別是MRSA菌株在人源和動物源性菌株的廣泛存在[14-15]，除此之外，在一些國家還分離到了動物源性耐萬古霉素金黃色葡萄球菌[16]。

在中國，金黃色葡萄球菌特別是MRSA不僅成為醫院和社區感染的重要病原菌，也是造成畜牧業重大經濟損失的重要病原之一，耐藥金黃色葡萄球菌通過食物鏈向人的傳播成為嚴重的公共衛生問題。關于動物源性金黃色葡萄球菌耐藥的報道呈逐年上升趨勢，但對重慶市金黃色葡萄球菌的耐藥情況還知之甚少。本研究在重慶市部分養殖場隨機采樣分離到了89株金黃色葡萄球菌，這些菌株分離自牛、豬、雞、山羊和兔。牛源菌株的分離率較低，這可能是由于金黃色葡萄球菌不是引起重慶地區奶牛乳房炎的主要病原，因為本研究采集的牛奶超過三分之一存在乳房炎。

從耐藥情況來看，分離菌株對青霉素類藥物嚴重耐藥，對四環素類藥物耐藥也較為嚴重，對大環內酯類、氨基糖苷類、酰胺醇類、林可胺類、喹諾酮類、磺胺類藥物也存在不同程度的耐藥，這可能與養殖場在飼料和飲水中添加此類藥物作為日常預防用藥有關，也與部分養殖場經常使用抗生素有關。山羊和家兔養殖中一般不在飼料和飲水中添加預防性抗菌藥物，這可能是羊源和兔源菌株的耐藥率遠遠低于其他來源菌株的重要原因。

本研究分離的多重耐藥菌株極為常見，特別是豬源多重耐藥菌株，這與在養豬生產中抗菌藥物的使用最為頻繁有關。羊源和兔源菌株多重耐藥情況較輕微，在養羊及養兔生產中，由于其細菌性疾病的發病率一般低于豬、牛和雞，因此一般很少在飼料和飲水中添加抗菌藥物，用于治療的頻率也低于上述兩種動物，因此羊源和兔源菌株的多重耐藥情況遠遠低于豬源和雞源菌株。

本研究分離的菌株對青霉素類和頭孢菌素類藥物廣泛耐藥，說明這些菌株可能為產ESBLs金黃色葡萄球菌。目前CSLI沒有金黃色葡萄球菌ESBLs篩選和確證試驗標準，故未進行金黃色葡萄球菌ESBLs表型篩選和確證。但這些菌株可能攜帶ESBL基因，故檢測了8個大類的ESBL基因。檢測的ESBL基因經BLAST序列比對，均為blaTEM-1a基因，說明在重慶市分離的動物源性金黃色葡萄球菌中blaTEM-1a基因型流行比較廣泛。在今后的研究中，還要加強對重慶地區金黃色葡萄球菌人源菌株和其他地區菌株中ESBL基因的檢測，以明確金黃色葡萄球菌主要攜帶的ESBL基因的基因型。

4 結 論

通過對重慶不同畜禽養殖場金黃色葡萄球菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗，初步分析重慶市不同動物來源的金黃色葡萄球菌的耐藥規律，對臨床用藥具有一定的指導意義。同時通過對金黃色葡萄球菌中ESBL基因的檢測，發現了ESBLs在金黃色葡萄球菌中的流行，且廣泛存在blaTEM-1a基因型。

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