綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白引起綿羊絨毛膜滋養層細胞的惡性轉化

趙 娟，徐斯日古楞，李慧萍，劉淑英，2*

(1.內蒙古農業大學 獸醫學院，呼和浩特 010018；2.農業部動物臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特 010018)

綿羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)是引起綿羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenocarcinoma，OPA)的病原，該病是綿羊肺分泌上皮細胞發生惡性轉化的一種傳染性肺癌[1-2]。綿羊肺腺瘤病毒含有標準的逆轉錄病毒基因gag、pro、pol和env[3]。研究報道在羔羊的接種試驗中，該病毒能夠在10 d內迅速誘導腫瘤，類似于攜帶致癌基因的急性轉化逆轉錄病毒[4]。JSRV-env基因主要編碼病毒的囊膜蛋白(Env)，具有表面蛋白(surface protein, SU)和跨膜蛋白(transmembrane protein, TM)兩個功能區[5]。SU負責與細胞表面的特異性受體結合，并且TM負責感染時病毒與細胞膜的融合。研究表明JSRV-env可作為致癌基因，單獨的JSRV Env蛋白可以轉化小鼠NIH3T3細胞[6]、大鼠208F細胞[7]、雞成纖維細胞[8]和犬上皮細胞[9]，并且可以在小鼠[10-11]和綿羊[12]中誘導肺癌，因此，JSRV的囊膜蛋白(Env)具有引起細胞轉化而致癌的罕見特征，但Env的致癌作用機制仍未解析清楚。

在綿羊基因組中存在大約27拷貝的與綿羊肺腺瘤病毒(JSRV)基因結構非常相似的內源性逆轉錄病毒(enJSRV)[13]，為了與之區別，JSRV也稱外源性綿羊肺腺瘤病毒(exogenous Jaagsiekte sheep retrovirus，exJSRV)。研究發現，exJSRV和enJSRV之間的序列除了三個區域的變異(VR1、VR2和VR3)以外具有高度同源性，其中VR3則映射到env基因部分，即TM蛋白的細胞質尾區[14]，而TM區的YXXM基序在所有轉化的JSRV中是必需的，但enJSRV的Env蛋白中不存在YXXM基序功能區，也無轉化功能[15]。而且缺失和/或突變試驗已經證明TM蛋白的細胞質尾區是轉化必不可少的[16-17]。哺乳動物的胎盤具有物質交換、分泌激素和防御等重要功能，在胎盤中行使這些功能的主要細胞類型是滋養層細胞[18]。本實驗室從正常胎盤組織中分離培養了一株永生化的滋養層細胞系用于細胞轉化試驗。因此本研究利用體外培養的永生化綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞，轉染重組真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env，用平板克隆以及軟瓊脂集落形成試驗，觀察細胞的惡性轉化以及細胞增殖情況，為進一步探討exJSRV Env的致癌功能提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

真核表達載體pEGFP-C1由本實驗室保存；重組真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env以及pEGFP-C1/enJSRV-env由本實驗室構建；永生化綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞由本實驗室建立。

1.2 主要試驗試劑

真核細胞轉染試劑LipofectamineTMLTX & PLUS購自Invitrogen公司；限制性內切酶KpnⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和ApaⅠ購自TaKaRa公司；DMEM細胞培養液、Opti-MEM培養液，0.25%胰蛋白酶購自GIBCO公司；胎牛血清(FBS)購自澳洲；瓊脂糖購自Invitrogen公司。

1.3 真核表達重組質粒的鑒定

成功構建重組真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env以及pEGFP-C1/enJSRV-env。重組真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env和pEGFP-C1/enJSRV-env分別用限制性內切酶HindⅢ、ApaⅠ和KpnⅠ、BamHⅠ水浴酶切，酶切結束后利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 永生化綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞培養及轉染效率的測定

將永生化綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞復蘇，放入37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，待長到80%時傳代。轉染的前一天，用胰蛋白酶消化并將細胞接種在六孔板內，加入2 mL無雙抗(青鏈霉素)的含20% FBS完全培養基。細胞密度應在轉染當天匯合度應達到80%左右。按照 LipofectamineTMLTX & PLUS轉染試劑說明分別轉染質粒 pEGFP-C1/exJSRV-env、pEGFP-C1/enJSRV-env以及空載體pEGFP-C1，不作處理的正常細胞作為空白對照組。48 h后進行免疫熒光照相，以及后續軟瓊脂集落形成試驗和平板克隆試驗。

1.5 軟瓊脂集落形成試驗

轉染48 h后的細胞用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，作活細胞計數，然后根據試驗要求做梯度倍數稀釋。用1.2%瓊脂糖溶液均勻鋪制細胞6孔板底層，置CO2溫箱中備用。將0.7%瓊脂糖溶液與約3 000個轉染后的細胞充分混勻，注入鋪有瓊脂糖底層的平皿中，置入37 ℃、5% CO2溫箱中，培養10～14 d。顯微鏡下觀察集落形成。

1.6 平板克隆試驗

對各組轉染的細胞進行細胞計數，以每皿50個和100個細胞放入六孔板中，加入3 mL含20% FBS的完全培養基，每組做3組平行試驗，置入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養10～14 d。每3 d換一次培養液。待肉眼可見的克隆形成時，用4%多聚甲醛固定并用結晶紫染色，顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數，計算克隆形成率(克隆形成率=克隆數/接種數×100%)，并用SPSS軟件作統計學分析。

2 結 果

2.1 pEGFP-C1/exJSRV-env和pEGFP-C1/enJSRV-env質粒酶切鑒定

將實驗室保存的重組真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env和pEGFP-C1/enJSRV-env經單、雙酶切鑒定(圖1)，結果顯示質粒正確，可以繼續使用。

2.2 綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞的最佳轉染效率

綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞瞬時轉染重組真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env和pEGFP-C1/enJSRV-env48 h后，熒光顯微鏡下觀察，結果顯示,在綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞的細胞質內彌漫大量的綠色熒光蛋白(圖2A、B)，表明重組真核表達質粒成功轉染綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞，可用于后續研究。

2.3 軟瓊脂集落形成試驗

轉染重組真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env的綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞接觸抑制性消失，且能夠在軟瓊脂上形成集落(圖3A)，說明綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞發生了惡性轉化；而轉染內源性病毒的重組真核表達質粒pEGFP-C1/enJSRV-env、空載體pEGFP-C1以及空白對照組細胞均不能在瓊脂上形成集落(圖3B、C、D)，說明綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞并未發生惡性轉化。

M. DNA相對分子質量標準(DL5000); 1、2. HindⅢ單酶切pEGFP-C1/exJSRV-env重組質粒; 3、4. Hind Ⅲ和ApaⅠ雙酶切pEGFP-C1/exJSRV-env重組質粒; 5. HindⅢ單酶切pEGFP-C1空質粒; 6. KpnⅠ單酶切pEGFP-C1空質粒; 7、8. KpnⅠ單酶切pEGFP-C1/enJSRV-env重組質粒; 9、10. KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切pEGFP-C1/enJSRV-env重組質粒M. DNA marker (DL5000); 1, 2. Digested product of pEGFP-C1/exJSRV-env with HindⅢ; 3, 4. Digested product of pEGFP-C1/exJSRV-env with HindⅢ and ApaⅠ; 5. Digested product of pEGFP-C1 with HindⅢ; 6. Digested product of pEGFP-C1 with KpnⅠ; 7, 8. Digested product of pEGFP-C1/enJSRV-env with KpnⅠ; 9, 10. Digested product of pEGFP-C1/enJSRV-env with Kpn Ⅰ and BamHⅠ圖1 重組質粒單、雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid by single and double restriction endonuclease digestion

2.4 平板克隆試驗

統計轉染 pEGFP-C1/exJSRV-env的細胞、轉染pEGFP-C1/enJSRV-env、pEGFP-C1以及未轉染的細胞形成的克隆數(圖4)，克隆形成率結果經SPSS軟件分析，轉染pEGFP-C1/exJSRV-env的綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞的克隆形成率極顯著高于其他三組，差異有統計學意義(P<0.01)(圖5)，轉染pEGFP-C1/enJSRV-env以及pEGFP-C1的細胞與未轉染的細胞之間無顯著差異(P>0.05)(圖5)。

3 討 論

目前，綿羊肺腺瘤逆轉錄病毒引起綿羊肺腺瘤病的致瘤轉化機制尚不清楚。M. Borobia等[19]將攜帶雙鏈DNA的JSRV質粒轉染到NIH 3T3細胞中導致轉化，證明JSRV攜帶致癌基因。將pCMV2JS21真核表達質粒轉染NIH 3T3細胞，形成轉化灶，而轉染對照組pCDNA3.1(-)質粒未有轉化灶形成[19]。本實驗室張宇飛等[20]證實將重組真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env轉染到293T細胞中也引起惡性轉化。以上研究結果均證明JSRV囊膜蛋白(Env)是腫瘤形成的主要因素。

A. 轉染重組質粒pEGFP-C1/exJSRV-env 48 h后的綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞；B. 轉染重組質粒pEGFP-C1/enJSRV-env 48 h后的綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞A. The ovine trophoblast cells transfected with recombinant plasmid pEGFP-C1/exJSRV-env after 48 h; B. The ovine trophoblast cells transfected with recombinant plasmid pEGFP-C1/enJSRV-env after 48 h圖2 轉染重組質粒后的綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞Fig.2 The ovine trophoblast cells transfected with recombinant plasmid

A.轉染重組質粒pEGFP-C1/exJSRV-env 的細胞；B.轉染重組質粒pEGFP-C1/enJSRV-env 的細胞；C.轉染空載體的細胞；D.空白對照A. Cells tranfected with recombinant plasmid pEGFP-C1/exJSRV-env; B.Cells transfected with recombinant plasmid pEGFP-C1/enJSRV-env; C. Cells transfected with plasmid pEGFP-C1; D. Blank control圖3 集落形成試驗(×100)Fig.3 Colony growth in soft agar(×100)

A. 每孔50個細胞；B. 每孔100個細胞；1.未轉染的綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞; 2.轉染空質粒pEGFP-C1的細胞; 3.轉染重組質粒pEGFP-C1/enJSRV-env的細胞; 4.轉染重組質粒pEGFP-C1/exJSRV-env的細胞A. 50 cells per well; B. 100 cells per well; 1. The sheep trophoblast cells without treatment; 2. Cells transfected with pEGFP-C1; 3. Cells transfected with pEGFP-C1/enJSRV-env; 4. Cells transfected with pEGFP-C1/exJSRV-env圖4 轉染后細胞平板克隆試驗Fig.4 Cells plate cloning experiments after transfection

各組間比較，***.P<0.01Asterisks indicate significand differences (***.P<0.01) when compared among the different groups圖5 克隆形成率柱狀圖Fig.5 Cloning efficiency histograms

3.1 Env引起綿羊絨毛膜滋養層細胞惡性轉化

為了更好地闡述JSRV Env蛋白的轉化機制，利用重組質粒pEGFP-C1/exJSRV-env轉染綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞，通過軟瓊脂集落形成試驗對該細胞發生的形態變化進行分析。正常的絨毛膜滋養層細胞不能在半固體軟瓊脂上懸浮生長形成集落，而惡性轉化的細胞獲得了錨定非依賴性生長能力可以生長形成集落。而本研究顯示轉染重組真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env的細胞形成集落，而轉染重組質粒pEGFP-C1/enJSRV-env、空質粒pEGFP-C1以及空白對照組細胞卻不能形成集落，這提示exJSRV囊膜蛋白(Env)促使綿羊絨毛膜滋養層細胞發生惡性轉化。M. Borobia等[19]研究顯示將缺失gag、pro、pol編碼序列的表達質粒pCMVJS21(pCMVJS21ΔGP，唯一完整的基因是env)轉染NIH3T3細胞產生轉化灶，并且將exJSRV的細胞質尾區與enJSRV交換的嵌合體卻不能轉化NIH3T3細胞，說明引起細胞發生轉化的必需是完整的囊膜蛋白，而本試驗所采用的真核表達質粒pEGFP-C1/exJSRV-env就是完整表達了SU 和TM的囊膜蛋白所發揮的作用。

3.2 Env對綿羊絨毛膜滋養層細胞增殖的影響

細胞增殖是檢測分裂中的細胞數量或者細胞群體發生的變化，克隆形成率反應細胞的增值能力。據報道地方性鼻病毒(ENTV)[21]、禽血管瘤病毒(AHV)[22]的囊膜蛋白(Env)也具有類似的致癌功能，AHV對NIH3T3細胞的增殖作用也通過AHVenv基因介導,通過將AHVenv基因克隆到基于MuLV的逆轉錄病毒載體中證明了這一點，并且用該重組質粒轉染NIH3T3細胞誘導細胞增殖和表型改變[22]。S. L. Liu等[9]將JSRV Env轉染犬腎細胞(MDCK)，發現轉染后的細胞增殖要顯著高于對照組。enJSRV-env對絨毛膜滋養層細胞的細胞融合也有一定的促進作用[23]。本實驗室杜方原等[24]將重組質粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env轉染到NIH3T3細胞也發生細胞增殖。而本研究中轉染重組質粒pEGFP-C1/exJSRV-env的細胞平板克隆試驗的克隆形成率也顯著高于對照組，說明了細胞在exJSRV囊膜蛋白(Env)的作用下，細胞發生增殖，與上述研究結果一致。目前研究表明在exJSRV囊膜蛋白致癌過程中可能有P53蛋白、表面蛋白A(surfactant protein A, SP-A)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、JSRV基質蛋白(JSRV matrix protein, MA)[25]、鋅指蛋白111(Zinc Finger Protein, Zfp111)[26]的參與，以及囊膜蛋白致癌過程也與細胞自噬[27]和信號通路[28]相關，本試驗結果為后續的研究提供了理論依據。

4 結 論

exJSRV囊膜蛋白能夠引起綿羊胎盤絨毛膜滋養層細胞發生惡性轉化以及細胞增殖。

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