單增李斯特菌CdaA的抗原表位分析及抗體的制備

孫靜娟 邱景璇 曾海娟 丁承超 王廣彬 李杰 王淑娟 劉箐

（1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2. 徐州綠健乳品飲料有限公司，徐州 221006）

單增李斯特菌是一種兼性厭氧細菌，同時也是胞內(nèi)寄生菌，能夠引起李斯特菌病。李斯特菌病的易感人群包括新生兒、孕婦、老年人和免疫受損的病人，感染死亡率極高［1-2］。單增李斯特菌廣泛存在于自然環(huán)境中，可以在冷藏溫度下生長繁殖，并能夠在較寬泛的鹽濃度、溫度和pH值條件下生存，使得其在食品加工企業(yè)很難得到控制［3］。另外，單增李斯特菌能夠黏附在食品加工器械上形成菌膜以逃避外界對它的殺傷，進而增加食品污染的可能性［4］。因此，能夠準(zhǔn)確高效地檢出樣品中單增李斯特菌就顯得非常重要。

相關(guān)學(xué)者研究了單增李斯特菌cdaA的結(jié)構(gòu)域分布及表達模式，并衍射出CdaA晶體結(jié)構(gòu)［5-6］。cdaA編碼的腺苷酸環(huán)化酶CdaA，催化線性二腺苷酸環(huán)化成環(huán)二腺苷酸（Cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-AMP），c-di-AMP作為第二信使參與重要的細胞活動，包括細胞壁代謝、維持DNA完整性、離子通道、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)［7］。最重要的是，c-di-AMP作為分泌因子能刺激宿主細胞胞質(zhì)反應(yīng)，激發(fā)先天免疫的胞漿途徑［8］。腺苷酸環(huán)化酶的過表達能引起宿主細胞在感染期間機體免疫反應(yīng)增強。研究表明，多種不同的菌群都能產(chǎn)生c-di-AMP［9］，海棲熱袍菌中DNA完整性掃描蛋白質(zhì)DisA首次發(fā)現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶［10］。除了DisA環(huán)化酶，枯草芽孢桿菌還依賴CdaA環(huán)化酶和CdaS環(huán)化酶協(xié)作調(diào)節(jié)c-di-AMP水平［11］，但單增李斯特菌只有一種CdaA類型的環(huán)化酶協(xié)作調(diào)節(jié)c-di-AMP水平。環(huán)化酶CdaA缺失會導(dǎo)致細菌生長遲緩［12］，因而CdaA在單增李斯特菌增殖過程中起到重要作用。

利用生物信息學(xué)工具從海量數(shù)據(jù)中篩選出來的單增李斯特菌cdaA具有種內(nèi)保守、種間特異的特點，抗原表位預(yù)測顯示CdaA具有良好的抗原表位，所以本研究對CdaA進行免疫學(xué)驗證，以CdaA為檢測靶標(biāo)檢測單增李斯特菌。CdaA的N端存在的跨膜區(qū)可能會使得CdaA的表達受阻，所以構(gòu)建pET30a系統(tǒng)原核表達Δ100CdaA，Ni柱純化后以Δ100CdaA為免疫原制備多克隆抗體和單克隆抗體，并測定了單抗的性質(zhì)。本研究嘗試用生物信息學(xué)篩選檢測靶標(biāo)并進行免疫學(xué)驗證，旨為篩選合理的檢測靶標(biāo)提供新的思路及為檢測單增李斯特菌奠定實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)條件 實驗菌株均由上海理工大學(xué)微生物研究所提供（表1），所有菌株均在37℃用腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）培養(yǎng)。

表1 33株實驗李斯特菌

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；高保真酶試劑盒（Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase）和一步克隆試劑盒（One Step Cloning Kit）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；一步法細菌活性蛋白提取試劑盒（One Step Bacterial Active Protein Extraction Kit）和His標(biāo)簽純化柱（Ni-IDA-Sefinose Column）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖割膠回收試劑盒（BioSpin Gel Extraction Kit）和質(zhì)粒抽提試劑盒（BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit）購自杭州博日科技生物有限責(zé)任公司；HAT培養(yǎng)基購自Sigma公司；96孔細胞培養(yǎng)板購自Costar公司；小鼠單抗亞型鑒定試劑盒購自洛陽佰奧通實驗材料中心。

1.2 方法

1.2.1 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 EGD-e菌株是研究單增李斯特菌的模式菌株，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上公布的單增李斯特菌EGD-e菌株上cdaA序列（Gene ID：984739）運用Primer3設(shè)計擴增cdaA的特異性引物F1-R1，引物信息見表2。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。割膠回收PCR產(chǎn)物連接至pET30a載體，導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。抽提質(zhì)粒，送上海華大基因科技有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果運用MEGA 5.0構(gòu)建NJ進化樹。

表2 引物信息

1.2.2 CdaA的生物信息學(xué)分析 運行綜合性數(shù)據(jù)庫NCBI上的ORF finder工具分析cdaA開放閱讀框。運行ExPASy的ProtParam程序分析預(yù)測CdaA的理化性質(zhì)［13］。運行SignalP4.1 Server程序預(yù)測CdaA是否含有信號肽及其剪切位點。運行TMHMM Server v.2.0程序預(yù)測CdaA是否為膜上蛋白及其跨膜區(qū)域。運行DNAstar 軟件的 protean程序預(yù)測CdaA的線性抗原表位［14-17］；運行SEPPA 2.0程序預(yù)測CdaA的空間抗原表位［18-19］。

1.2.3 原核表達與純化

1.2.3.1 引物設(shè)計 前期實驗發(fā)現(xiàn)CdaA的誘導(dǎo)表達效果不明顯，優(yōu)化誘導(dǎo)條件也不能提高表達水平，考慮到CdaA的跨膜區(qū)會阻礙原核表達，所以根據(jù)NCBI上公布的cdaA序列運用Primer3設(shè)計特異性引物F2-R2，用于擴增Δ300cdaA片段，即缺少形成跨膜區(qū)的第1-300 bp的基因片段，引物信息見表2。

1.2.3.2 Δ300cdaA的擴增與克隆 根據(jù)高保真酶試劑盒的推薦參數(shù)設(shè)置PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 95℃ 3 min；變性95℃ 15 s，退火56℃ 15 s，延伸72℃ 45 s，35個循環(huán)；徹底延伸72℃ 5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，割膠回收Δ300cdaA片段并克隆至pET30a載體上，將pET30a-Δ300cdaA轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，PCR鑒定為陽性的菌落，抽提質(zhì)粒送上海華大基因科技有限公司進行測序，將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。

1.2.3.3 Δ100CdaA的原核表達與可溶性分析 培養(yǎng)含pET30a-Δ300cdaA重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3），37℃，200 r/min，培養(yǎng)至OD600nm為0.6時加入 IPTG 誘導(dǎo) pET30a-Δ300cdaA表達 Δ100CdaA，IPTG終濃度0.1 mmol/L，誘導(dǎo)時間4 h。誘導(dǎo)完成后，采用一步法細菌活性蛋白提取試劑盒從大腸桿菌BL21（DE3）中提取可溶性蛋白，之后用8 mol/L尿素處理包涵體，SDS-PAGE和Western blotting鑒定重組蛋白的誘導(dǎo)表達情況。

1.2.3.4 Δ100CdaA的分離純化 Δ100CdaA誘導(dǎo)表達完成后離心收集菌體，PBS緩沖液重懸菌體，使用超聲破碎儀冰浴破碎菌體，離心棄去上清，用6 mol/L鹽酸胍變性包涵體，參照Ni柱說明書純化His標(biāo)簽重組蛋白并鑒定目的蛋白的純化效果。

1.2.4 動物免疫 適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，以純化的Δ100CdaA為免疫原，采用背部皮下多點免疫的方式免疫動物，2 kg大耳兔的免疫劑量為1 mg蛋白；8周齡的小鼠的免疫劑量為60 μg的蛋白。初次免疫時弗氏完全佐劑與免疫原等體積混合乳化后免疫，之后免疫時使用弗氏不完全佐劑，間隔兩周免疫一次［20］。

1.2.5 多克隆抗體效價測定及Western blotting 分析 三免后一周耳邊緣取血，以純化的Δ100CdaA包板，以梯度稀釋的兔血清為一抗（稀釋度為1∶1 000-1∶128 000），以HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗，采用間接ELISA法檢測血清中抗體水平［21］。溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法提取單增李斯特蛋白［22］，SDS-PAGE電泳并將蛋白條帶印跡至NC膜上，以兔血清為一抗，以熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗，使用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)Odyssey掃描NC膜，分析多抗與單增李斯特菌提取蛋白的結(jié)合能力。

1.2.6 單克隆抗體的制備 三免后一周斷尾采血，間接ELISA測定小鼠血清中特異性抗體水平。抗體效價最高的小鼠在沖擊免疫后用于細胞融合。實驗中以50% PEG（MW1500）作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，用HAT培養(yǎng)基對雜交瘤細胞進行篩選，間接ELISA法測定孔板細胞培養(yǎng)液中抗體的效價，采用有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆，篩選出既由單個細胞分裂而成又能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的細胞株。將篩選的細胞株擴大培養(yǎng)，注射入小鼠腹腔誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生腹水，從而獲得大量單克隆抗體。

1.2.7 單克隆抗體性質(zhì)的測定

1.2.7.1 單克隆抗體的純化 收集腹水，飽和硫酸銨沉淀法粗提抗體后，使用蛋白純化儀protein G柱單抗精提，SDS-PAGE電泳測定抗體純化效果。

1.2.7.2 單克隆抗體亞型測定及效價測定 采用間接ELISA法測定鼠源單克隆抗體的亞型，以1 000倍稀釋的單抗為一抗，以6種HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA）為二抗，避光顯色20 min后，藍色孔對應(yīng)的酶標(biāo)二抗的亞型就是單抗的亞型。以梯度稀釋的單抗為一抗（稀釋度為1∶1 000-1∶512 000），以HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體為二抗，間接ELISA檢測單抗的效價。

1.2.7.3 單克隆抗體特異性測定 培養(yǎng)單增李斯特菌（EGD-e、ATCC43251、ATCC13932、ATCC191-12、ATCC19114、ATCC19115、ATCC19116、ATCC-19117、CMCC 54002）、非致病李斯特菌（CICC216-72、CICC21663和CICC10297）、大腸桿菌O157∶H7（ATCC43895、ATCC43889）、金黃色葡萄球菌（ATCC27660）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）、腸炎沙門氏菌（ATCC13076）、阪崎腸桿菌（ATCC29004）、福氏志賀氏菌（ATCC12022）共19株細菌。按溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法提取細菌全蛋白，Western blotting法測定該單抗的特異性。

2 結(jié)果

2.1 進化樹的構(gòu)建及分析

實驗室保存的26株李斯特菌基于cdaA建立NJ進化樹，如圖1所示，由進化樹分析可知cdaA在單增李斯特菌中高度保守。將cdaA序列提交至NCBI上Nucleotide collection數(shù)據(jù)庫進行比對，顯示同源性＞98%。

圖1 基于cdaA核酸序列構(gòu)建NJ進化樹

2.2 CdaA的生物信息學(xué)分析

cdaA全長822 bp作為一個開放閱讀框，編碼273個氨基酸。經(jīng)ProtParam 程序分析，CdaA分子量為30.44 kD，等電點理論值7.91，酸性氨基酸總數(shù)（Asp + Glu）為29個，堿性氨基酸總數(shù)（Arg +Lys）為30個，不穩(wěn)定指數(shù)為40.83，屬不穩(wěn)定蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)為118.57，平均親水系數(shù)為0.241，為疏水性蛋白，不可溶。

2.2.1 信號肽預(yù)測 如圖2，表3所示，信號肽預(yù)測結(jié)果顯示信號肽分值S平均值（mean S-score）＜0.5［23］，表明CdaA不存在信號肽片段，不是分泌蛋白。

圖2 CdaA信號肽預(yù)測

表3 CdaA信號肽預(yù)測的數(shù)值信息

2.2.2 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測 如圖3，表4所示，跨膜預(yù)測結(jié)果表明CdaA 的N端大約前80個氨基酸肽鏈來回穿梭細胞膜存在兩個跨膜區(qū)。

圖3 CdaA跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

表4 CdaA跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測的數(shù)值信息

2.2.3 線性抗原表位預(yù)測 運用DNAstar軟件預(yù)測線性抗原表位的結(jié)果如圖4所示，圖上縱坐標(biāo)表示抗原指數(shù)，得分大于0，則該位置容易形成抗原表位。可知大約前80個氨基酸不構(gòu)成抗原表位，原因可能是這些氨基酸嵌入膜結(jié)構(gòu)，未暴露出來構(gòu)成抗原表位，與跨膜區(qū)域預(yù)測結(jié)果相符。

2.2.4 空間抗原表位預(yù)測 將CdaA空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)提交至SEPPA2.0服務(wù)器預(yù)測空間抗原表位，0到1表示氨基酸打分，分值越高顏色越紅，則表示該氨基酸越有可能成為抗原表位。如圖5所示，紅色區(qū)域裸露在外側(cè)且分布相對集中，顯示CdaA具有良好的空間抗原表位。

2.3 Δ300cdaA的擴增與pET30a-Δ300cdaA的鑒定

以單增李斯特菌EGD-e菌株為模板，以F2-R2為引物進行PCR擴增，擴增片段大小為522 bp，與預(yù)期片段大小一致（圖6）。重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果如圖7所示，在522 bp處出現(xiàn)陽性條帶，與預(yù)期片段大小一致，說明Δ300cdaA克隆至pET30a載體上，并成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的cdaA序列同源性100%。

2.4 Δ100CdaA的誘導(dǎo)表達與可溶性分析

SDS-PAGE結(jié)果（圖8-A）顯示，重組質(zhì)粒pET30a-Δ300cdaA的誘導(dǎo)表達效果明顯，在23 kD處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致，并且Δ100CdaA在BL21（DE3）菌體內(nèi)以包涵體的形式存在。Western blotting結(jié)果（圖8-B）顯示在23 kD處呈現(xiàn)出特異性條帶，表明該蛋白能與抗His抗體特異性結(jié)合，證實是Δ100CdaA。

2.5 Δ100CdaA的分離純化

采用鎳柱對Δ100CdaA 進行純化，SDS-PAGE（圖9-A）分析表明純化效果明顯，在23 kD 處出現(xiàn)蛋白條帶；經(jīng)Western blotting分析（圖9-B）在23 kD處出現(xiàn)特異性條帶，確實是Δ100CdaA。

圖4 CdaA線性抗原表位預(yù)測

圖5 CdaA空間抗原表位預(yù)測

圖6 Δ300cdaA的擴增

圖7 重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.6 多克隆抗體效價的測定

采用間接ELISA法測兔血清效價，OD450nm值大于陰性對照的2.1倍即可認(rèn)定為最終效價。由圖10可知，以Δ100CdaA多次免疫大耳兔后，兔子血清抗體水平較高，效價可達到1∶128 000。

圖8 Δ100CdaA的誘導(dǎo)表達及鑒定

圖9 Δ100CdaA的純化及鑒定

圖10 兔子血清效價的測定

2.7 Western blotting檢測單增李斯特菌

在單增李斯特菌中cdaA編碼的CdaA分子量為30 kD，由圖11可知，在大約30 kD的位置呈現(xiàn)出蛋白印跡，與預(yù)測大小相符，兔多抗可與從單增李斯特菌中提取的CdaA結(jié)合，表明已成功制備多抗，但是多抗與其他雜蛋白存在交叉，特異性有待提高。

圖11 多抗檢測單增李斯特菌

2.8 單克隆抗體的純化

如圖12所示，泳道1為飽和硫酸銨沉淀法粗提的單抗，泳道2為親和層析柱純化過程中的穿透液，在55 kD左右沒有目標(biāo)蛋白條帶，表明在純化過程中抗體沒有丟失，泳道3為洗脫的單抗，在55 kD左右有一明顯條帶，為抗體的重鏈，在26 kD左右有一明顯條帶，為抗體輕鏈，除此之外沒有雜帶，表明純化后單抗純度較高。

2.9 單克隆抗體亞型的測定及效價測定

經(jīng)細胞融合、有限稀釋法篩選出一株雜交瘤細胞3F8F11C4D3，亞型測定結(jié)果（表5）顯示抗體亞型為IgG2a。間接ELISA測定單克隆抗體的效價可達1∶512 000，如圖13所示。

圖12 單抗的純化

表5 單抗亞型的測定

圖13 單抗效價的測定

2.10 單克隆抗體特異性測定

Western blotting分析該單抗與9株單增李斯特菌、3株非致病李斯特菌以及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等7株其他菌種的交叉反應(yīng)，結(jié)果如圖14、圖15所示，該單抗能夠與9株致病性單增李斯特菌和2株非致病李斯特菌蛋白結(jié)合，并且與7株其他菌種的蛋白不存在交叉，因而，該抗體具有較好的特異性。

3 討論

圖14 單抗與李斯特菌的交叉反應(yīng)結(jié)果

圖15 單抗與其他致病菌的交叉反應(yīng)結(jié)果

通過生物信息學(xué)的方法在數(shù)據(jù)庫中篩選出單增李斯特菌中種內(nèi)保守、種間特異的蛋白CdaA，然后用DNAstar軟件和SEPPA2.0程序預(yù)測其具有良好的抗原表位，DNAstar 軟件綜合考慮二級結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性和表面可及性等多個因素預(yù)測線性抗原表位［24］；SEPPA2.0程序是以蛋白三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的預(yù)測空間抗原表位，但每種預(yù)測方法都有一定的局限性，加上體內(nèi)免疫應(yīng)答機制復(fù)雜，預(yù)測的抗原表位是否具有免疫原性還需要進一步免疫學(xué)驗證。

前期原核表達CdaA效果不佳，優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件也不能提高蛋白表達量，這可能與N端存在跨膜區(qū)相關(guān)。跨膜蛋白在原核表達過程中受阻一方面是由于結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜性，鑲嵌在膜中的蛋白質(zhì)呈α螺旋結(jié)構(gòu)；另一方面是由于功能多樣性，膜蛋白作為離子通道具有一定的轉(zhuǎn)運功能，也可作為信號分子具有傳遞信號的功能，為維持細胞內(nèi)部穩(wěn)定平衡，膜蛋白的合成可能受到嚴(yán)格調(diào)控［25-26］。跨膜區(qū)肽段嵌于膜內(nèi)，呈α螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)規(guī)則且不易變形，決定了跨膜區(qū)氨基酸不易形成抗原表位。線性抗原表位預(yù)測顯示CdaA的N端形成跨膜區(qū)的前100個氨基酸確實不易形成抗原表位，抗原表位多分布在非跨膜區(qū)，因而可采取分段表達的方式表達非跨膜區(qū)蛋白［27-28］。

在此基礎(chǔ)上，原核表達了Δ100CdaA，以Δ100CdaA為免疫原制備的多抗效價可達1∶128 000，該多抗能夠與從單增李斯特菌提取的CdaA結(jié)合，但是多抗本身具有多個結(jié)合位點，特異性有待提高。制備的單抗效價可達1∶512 000，能夠檢測9株單增李斯特菌和2株非致病李斯特菌，與大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等7株其他致病菌無交叉，特異性較好。雖然制備的多克隆抗體和單克隆抗體不能直接結(jié)合單增李斯特菌，只能夠通過提取細菌蛋白來檢測單增李斯特菌，因而無法實現(xiàn)快速檢測，但是這些不足是可以選擇更合理的檢測靶標(biāo)及保持免疫原的空間結(jié)構(gòu)解決。本研究對于用生物信息學(xué)篩選檢測靶標(biāo)以制備特異性高、廣譜性好的單增李斯特菌抗體的這一想法具有重要現(xiàn)實意義。

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建cdaA進化樹和序列比對發(fā)現(xiàn)該基因在單增李斯特菌中高度保守，運用生物信息學(xué)方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)CdaA存在良好抗原表位，CdaA原核表達受阻可能與該蛋白N端存在跨膜區(qū)有關(guān)。原核表達并純化了Δ100CdaA，Δ100CdaA蛋白具有良好的免疫原性，以Δ100CdaA制備的多抗效價可達1∶128 000，制備的單抗效價可達1∶512 000，多抗和單抗均可與從單增李斯特菌提取的CdaA結(jié)合，并且單抗具有良好的特異性。

［1］Donnelly CW.Listeria monocytogenes：a continuing challenge［J］.Nutrition Reviews, 2001, 59（6）：183-194 .

［2］V?limaa AL, Tilsala-Timisj?rvi A, Virtanen E. Rapid detection and identification methods forListeria monocytogenesin the food chain［J］. Food Control, 2015, 55：103-114.

［3］Vongkamjan K, Fuangpaiboon J, Jirachotrapee S. Occurrence and diversity ofListeriaspp.in seafood processing plant environments［J］. Food Control, 2015, 50 ：265-272.

［4］Kocot AM, Olszewska MA. Biofilm formation and microscopic analysis of biofilms formed byListeria monocytogenesin a food processing context［J］. LWT-Food Science and Technology, 2017,84：47-57.

［5］Rosenberg J, Dickmanns A, Neumann P. Structural and biochemical analysis of the essential diadenylate cyclase CdaA fromListeria monocytogenes［J］. J Biol Chem, 2015, 290（10）：6596-6606.

［6］Rismondo J, Gibhardt J, Rosenberg J. et al. Phenotypes associated with the essential diadenylate cyclase CdaA and its potential regulator CdaR in the human pathogenListeria monocytogenes［J］.J Bacteriol, 2015, 198（3）：416-426.

［7］Commichau FM, Dickmanns A, Gundlach J. A jack of all trades：the multiple roles of the unique essential second messenger cyclic di-AMP［J］. Mol Microbiol, 2015, 97（2）：189-204.

［8］Woodward JJ, Iavarone AT, Portnoy DA. C-di-AMP secreted by intracellularListeria monocytogenesactivates a host type I interferon response［J］. Science, 2010, 328（5986）：1703-1705.

［9］Corrigan RM, Gründling A. Cyclic di-AMP ：another second messenger enters the fray［J］. Nature Reviews Microbiology, 2013,11（8）：513- 524.

［10］Witte G, Hartung S, Büttner K. Structural biochemistry of a bacterial checkpoint protein reveals diadenylate cyclase activity regulated by DNA recombination intermediates［J］. Molecular Cell, 2008, 30（2）：167-178.

［11］Mehne FM, Gunka K, Eilers H. Cyclic-di-AMP homeostasis in Bacillus subtilis：both lack and high level accumulation of the nucleotide are detrimental for cell growth［J］. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288（3）：2004-2017.

［12］Witte CE, Whiteley A T, Burke T P, et al. Cyclic di-AMP is critical forListeria monocytogenesgrowth, cell wall homeostasis, and establishment of infection［J］. MBio, 2013, 4（3）：e00282-13.

［13］王芬, 王海龍, 殷麗天, 等. 剛地弓形蟲磷酸甘油酸酯變位酶2基因編碼蛋白主要特性與抗原表位的生物信息學(xué)分析［J］.中國病原生物學(xué)雜志, 2010, 5（11）：840-843.

［14］胡純秋, 高金燕, 羅春萍, 等. 花生過敏原Ara h2. 02二級結(jié)構(gòu)和B細胞抗原表位預(yù)測［J］. 食品科學(xué), 2009, 30（21）：13-15.

［15］朱盼, 陳紅兵, 胡純秋, 等. 基于表位預(yù)測的花生過敏原Ara h6免疫交叉反應(yīng)性研究［J］. 食品科學(xué), 2010, 31（17）：318-322.

［16］李江英, 白雪娟, 梁艷, 等. 用DNAStar軟件預(yù)測Rv1410c結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原表位［J］. 細胞與分子免疫學(xué)雜志,2015, 31（4）：474-477.

［17］朱丹丹, 段義農(nóng), 陳金鈴. 卡氏肺孢子蟲kexin蛋白抗原表位預(yù)測［J］. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2011, 38（6）：1077-1079.

［18］Qi T, Qiu TY, Zhang QC, et al. SEPPA 2. 0-more refined server to predict spatial epitope considering species of immune host and subcellular localization of protein antigen［J］. Nucleic Acids Research, 2014, 42（W1）：59-63.

［19］Sun J, Wu D, Xu TL, et al. SEPPA：a computational server for spatial epitope prediction of protein antigens［J］. Nucleic Acids Research, 2009, 37：W612-W616.

［20］任曉峰, 賈文龍. 豬流行性腹瀉病毒S1蛋白截短表達及多抗制備［J］. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 44（9）：46-50+2.

［21］李志清, 向軍儉, 李雨辰, 等. 單增李斯特菌InternalinA的表達、純化及多克隆抗體的制備［J］. 微生物學(xué)通報, 2012, 39（4）：495-502.

［22］徐宗凱, 林青青, 周夢瑩, 等. 三種李斯特菌菌體蛋白提取方法的比較［J］. 生命科學(xué)研究, 2015, 19（1）：29-33.

［23］吳祖建, 高芳鑾, 沈建國. 生物信息學(xué)分析實踐［M］. 北京：科學(xué)出版社, 2010：112-116.

［24］李晉濤, 陳正瓊, 梁志清, 等. Eppin抗原的二級結(jié)構(gòu)分析B細胞表位預(yù)測［J］. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2008, 30（24）：2254-2257.

［25］廖丹, 謝建平, 王洪海. 結(jié)核分枝桿菌膜蛋白的異源表達與純化研究進展［J］. 微生物學(xué)報, 2007, 47（5）：932-936.

［26］左利民, 康艷晶, 羅施中. α-螺旋跨膜蛋白的折疊和自組裝［J］. 科學(xué)通報 , 2010, 55（15）：1426- 1437.

［27］岳麗琴, 周育森, 張庶民, 等. B族鏈球菌C5a肽酶表位的預(yù)測、分段表達及其免疫原性［J］. 中國生物制品學(xué)雜志, 2010, 23（5）：460-465.

［28］謝樂新, 李淼, 宋帥, 等. 副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5的分段表達及免疫學(xué)性質(zhì)分析［J］. 華北農(nóng)學(xué)報, 2013（5）：48-52.