基于諾麗葉片愈傷組織的細胞懸浮系的建立

張正雪 藍增全 吳田

（1. 西南林業大學環境科學與工程學院，昆明 650224；2. 西南林業大學園林學院，昆明 650224）

諾麗是一種常綠的熱帶多年生闊葉小喬木或灌木，由英文名Noni翻譯而來，別名海巴戟、諾尼［1］、四季果［2］等，是巴戟天屬茜草科植物，拉丁名為Morinda citrifoliaL，發源于南太平洋島嶼［3］，因其對溫度的特殊需求，生境較為苛刻，故而在全球的分布較為狹窄。主要分布于大溪地、夏威夷、印度尼西亞、菲律賓、以及我國的海南島、西沙群島［4］和臺灣島、云南西雙版納［5］等。諾麗葉含有很多生化成分，有比較強的抗氧化能力［6］，主要是抗氧化劑和生物類黃酮，如萜烯類化合物［7-11］和黃酮甙類等［7］。2009年張偉敏等［12］實驗證明了諾麗葉片具有降血壓血糖和抗氧化的能力。

近年來，研究者們通過建立藏紅花的細胞懸浮系獲得了藏紅花素［13］，通過建立喜樹［14］和新疆雪蓮［15］等植物的細胞懸浮系，也分別獲得了喜樹堿［16］和黃酮［15］。國內目前對諾麗的使用主要是諾麗果，而對諾麗葉片的使用幾乎沒有，實際上葉片中富含一些抗氧化劑和生物類黃酮類物質。因此，在本課題組前期對諾麗的不同外植體（根、莖、葉）進行了愈傷組織誘導［17-19］的基礎上，本實驗擬通過探索MS液體培養基的激素組成、初始接種量以及在細胞懸浮培養過程中pH值的變化、懸浮細胞生長曲線、細胞活力、細胞形態和細胞存活率等參數，確定繼代周期，完成諾麗葉片細胞懸浮體系的建立，以為后續諾麗葉片中次生代謝物的誘導奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用材料為淡黃色、質地疏松的愈傷組織。參照前人諾麗葉片愈傷組織誘導的方法，以實驗室培養的諾麗無菌苗葉片為外植體進行誘導和繼代的愈傷組織，愈傷組織誘導培養基為：MS + 0.1 mg/L 6-BA（6-芐氨基嘌呤）+ 2.0 mg/L 2，4-D（2，4氯化苯氧乙酸）；愈傷組織繼代培養基為：MS+2.0 mg/L NAA（a-萘乙酸）+0.1 mg/L KT（激動素）［19］。

1.2 方法

1.2.1 諾麗葉片細胞懸浮培養的液體培養基 以愈傷組織誘導和繼代的培養基配方為參考，以MS為基本培養基，每1 000 mL培養基附加激素（激素組合和濃度見表1）、蔗糖3%、pH 5.8、分裝、121℃下滅菌20 min。

懸浮細胞培養過程中，每2 d取兩瓶懸浮細胞培養液測定一次細胞鮮重，生長量以濕細胞鮮重計。取2 mL 培養液，4℃下5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，稱量底部沉淀細胞鮮重。細胞生長速度以比生長速率計，比生長速率（d-1）=（培養結束時細胞鮮重-接種細胞鮮重）/接種細胞鮮重/培養天數。

1.2.2 諾麗葉片細胞懸浮培養過程 選取繼代培養后淡黃色、分散性好、生長良好的愈傷組織，在超凈工作臺上用鑷子將其夾碎，轉接于MS液體培養基中，每250 mL的培養瓶中加入液體培養基50 mL。實驗設計1.5 g、2.5 g、3 g、4 g這4個不同初始接種量，接種完成后，置于轉速110 r/min、溫度（25±2）℃的搖床上進行暗培養。分別觀察愈傷組織在液體中的生長變化狀況，進行統計、比較、篩選。每隔7 d繼代培養1次，繼代時除去大塊愈傷組織，培養液按照與新鮮培養液1：2的比例進行混合再培養。篩選分散度好、較均勻、生長快的細胞作為母細胞，多次繼代后得到性能良好、穩定的懸浮細胞系。

表1 不同激素組合和濃度培養基

1.2.3 培養液pH值的測定 每2 d測定一次培養液的pH值，用PHS-3CW型數顯酸度計測定培養液pH。每次使用前，先用預先配制好的標準試劑校準，以確保儀器測量值的準確性。3瓶分別測量，測量數據取平均值，以培養時間為橫坐標，pH值為縱坐標，繪制諾麗葉片細胞懸浮液pH變化曲線。

1.2.4 細胞懸浮生長曲線的測定 測定pH值的同時用血球計數板法檢測懸浮培養液中的細胞數，記錄其生長情況。從初次培養時開始，在其培養過程中，每2 d取3瓶懸浮細胞培養液，先用0.25% 的果膠酶對細胞團處理，讓懸浮培養的細胞呈游離單細胞，便于細胞計數，再進行細胞數量的多次檢測，取平均值作為最優數據記錄。以培養時間為橫坐標，懸浮細胞數量為縱坐標，繪制諾麗葉片懸浮細胞生長曲線。

1.2.5 TTC法測定細胞活力 用TTC法［20］測定細胞活力，以掌握細胞各時期的活力以便于后續實驗的開展和對懸浮系的利用。

1.2.6 細胞形態的觀察 每2 d進行一次細胞生長與變化情況的觀察。采用觀察培養的活細胞的倒置顯微鏡（40×）進行觀察，拍照記錄細胞的生長變化情況。

1.2.7 懸浮細胞存活率的測定 懸浮細胞培養結束后，先配制0.1% 酚藏花紅溶液。檢查時將經0.25%的果膠酶處理過的懸浮細胞取一滴放在載玻片上，滴一滴0.1% 酚藏花紅溶液，蓋上蓋玻片，在低倍鏡下，隨機計數上、下、左、右、中5個視野內的細胞總數和被染成紅色的細胞數，紅色細胞為死細胞，按以下公式計算細胞存活率：懸浮細胞存活率（%）=［（細胞總數-死亡細胞數）/懸浮細胞總數］×100%。

1.2.8 細胞平板培養 為了檢測懸浮細胞的活性，用培養皿分裝固體MS培養基，將穩定的懸浮細胞培養液涂布在該培養基上進行平板培養，涂布后密封培養皿并將其置于溫度（25±2）℃條件下暗培養。

2 結果

2.1 諾麗葉片懸浮細胞在不同液體培養基中的生長情況

經測定、計算可得到諾麗葉片懸浮細胞在3種液體培養基中的細胞生長速度（圖1）。諾麗葉片懸浮細胞在3種液體培養基的細胞生長速度有所不同，且差異顯著，懸浮細胞在MS+2.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養基中比生長速率顯著高于其它兩種培養基。在培養基MS+2.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/LNAA中細胞比生長速率為0.0398/d；在培養基MS+2.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT 中懸浮細胞比生長速率為0.0753/d；在培養基MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA中比生長速率僅有0.026/d。因此，選定MS+2.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT作為諾麗葉片懸浮培養的MS液體培養基。

圖1 3種不同液體培養基中諾麗葉片懸浮細胞的比生長速率

2.2 不同初始接種量對諾麗葉片懸浮細胞生長的影響

實驗設計4個初始接種量，不同初始接種量下細胞生長速率不同（圖2）：在液體培養基中，初始接種量為1.5-3 g/50 mL，隨著接種量的增加，懸浮細胞的比生長速率成遞增趨勢，繼續增加接種量至4 g/50 mL細胞的比生長速率開始下降，同時褐變現象嚴重，可能是因為接種量的增加，培養到中后期時培養基里的營養物質消耗過多，造成培養細胞營養缺乏而死亡。因此，選定3 g/50 mL為適宜初始接種量。

圖2 不同初始接種量下細胞的生長情況

2.3 培養液pH值的測定

pH是影響細胞生長的因子，培養基的pH可以改變營養元素的離子化狀態，進而影響細胞新陳代謝活性。諾麗葉片細胞懸浮液的pH變化呈先下降后上升逐漸平穩下降趨勢（圖3），由初始的pH 5.8在第4天下降到最低4.21，后逐漸升高，到14-16 d恢復到5.8，之后逐漸趨于平穩。前期的pH值下降與后期的pH值上升，這可能與細胞培養液中各種離子的不等量吸收以及細胞在新陳代謝中釋放的物質酸堿性有關。根據培養液pH值的這種變化情況，可初步確定諾麗葉片細胞懸浮培養液的最佳繼代周期為22 d左右。

圖3 諾麗葉片懸浮細胞培養液pH值變化情況

2.4 諾麗葉片懸浮細胞生長曲線

在附加2 .0 mg/L NAA和0.2 mg/L KT的MS培養基中進行諾麗葉片細胞懸浮培養。初始接種量為3 g/50 mL。通過定期測定細胞數量，可以了解細胞的生長狀況（圖4）：諾麗葉片細胞懸浮培養的生長曲線成“S”型，接種后6 d為滯后期，這可能是細胞尚未適應新的生長環境；隨后的6-14 d進入對數生長期，此時細胞細胞分裂活躍，生長加快，增長迅速；之后在14-26 d時進入直線生長期，是細胞增殖、生長和發育最明顯的時期，細胞數量在26 d時達到最大值11.76×105個/mL。26 d后細胞數量下降，進入較長的生長靜止期（26-30 d）。因此，結合與諾麗葉片細胞在懸浮培養的過程中的pH值的變化情況，可確定最佳繼代培養時間是22-26 d。

圖4 諾麗葉片細胞懸浮培養生長曲線圖

2.5 諾麗葉片懸浮細胞的活力曲線

對諾麗懸浮細胞活力曲線進行測定，細胞新陳代謝越旺盛其OD值越高（圖5），且細胞呈深紅色。以葉片為外植體的懸浮細胞，剛接入培養基諾麗細胞活力OD值在0.9，隨著培養天數的增加OD值在21 d達到1.8，隨后平穩。

綜上，細胞懸浮生長曲線、懸浮液pH值、細胞活力曲線之間存在一定對應關系。諾麗葉片細胞懸浮培養液細胞生長曲線在14-22 d進入直線生長期，而此時懸浮液的pH值在5.67-5.97，用細胞存活力在第18 d 細胞活力值最大OD485=1.8，對應了細胞生長曲線與pH，此時期細胞懸浮液生長狀態較好。

圖5 諾麗葉片懸浮細胞活力測定

2.6 諾麗葉片懸浮細胞形態觀察

懸浮細胞在倒置顯微鏡的觀察下，細胞不同時期的生長變化情況不同（圖6）。初代細胞懸浮液中，大量細胞聚集，形成細胞團（圖6-A）；第3代開始出現明顯變化，形成桿狀細胞（圖6-B）；第5代時有少量圓細胞形成，大量細胞有形成圓細胞的趨勢（圖6-C）；隨著繼代次數的增加逐漸呈20-30個左右的小細胞聚集體，第6代后呈較規則的圓球體，細胞核明顯（圖6-D）。說明隨著繼代次數的增加，細胞懸浮體系逐步趨于穩定。

圖6 諾麗葉片懸浮細胞40×顯微鏡下形態變化圖

2.7 懸浮細胞存活率的測定

細胞懸浮培養在繼代5-8次以后，形成穩定的懸浮培養液，將培養結束的穩定懸浮培養液進行細胞存活力測定，染色后活細胞無色，死亡細胞呈紅色（圖7），以葉片為外植體的細胞懸浮培養存活力達77.9%。

圖7 諾麗懸浮細胞染色后活細胞和死細胞

2.8 細胞平板培養

細胞平板培養中，暗培養下15 d左右開始形成愈傷組織（圖8-A），23 d左右大量增殖（圖8-B），兩實驗表明諾麗葉片懸浮培養中細胞存活率高。

圖8 平板培養產生的愈傷組織

3 討論

通過對實驗的觀察記錄分析得知，雖然不同的激素組合對懸浮細胞比生長速率的影響不同，但每個組合的培養基中細胞都在生長。本實驗中，NAA和KT搭配對細胞增殖的促進效果比較好，而2，4-D和6-BA 組合的培養基中細胞的比生長速率不太理想。前人研究表明，在適宜濃度下2，4-D和6-BA對懸浮系中細胞增殖大多有促進作用，前人在西洋參細胞懸浮系的液體培養基中使用了1.0 mg/L 2，4-D［21］，在黃芩細胞懸浮培養中使用了0.2 mg/L 2，4-D［22］。筆者認為在諾麗葉片愈傷組織細胞懸浮系中，在確定NAA和KT對細胞增殖起積極作用的同時，合適濃度的2，4-D可能也對其起促進作用。

細胞懸浮系的培養具有獲得次生代謝物的同時不傷害植物本身的優點，本研究對諾麗葉片進行細胞懸浮培養研究，獲得了穩定諾麗葉片細胞懸浮培養液，穩定的諾麗細胞懸浮培養液可再生愈傷組織及外植體，以及建立諾麗細胞懸浮培養動力學模型，同時鑒于諾麗葉片本身所含有的生物類黃酮和蒽醌類物質的藥用價值［12］，后續將通過諾麗葉片細胞懸浮系對其二者進行誘導，研究者使用TDZ（噻苯隆）在銀杏細胞懸浮培養體系中誘導細胞二萜類化合物的產生［23］，在黃芩細胞懸浮培養中加入2，4-D和6-BA時，黃芩苷的積累量最大［22］。本課題組在后續的實驗中，擬在懸浮系中加入2，4-D，6-BA 和TDZ，并對濃度梯度進行探索，對諾麗葉片中的萜烯類物質進行誘導和富集。

4 結論

實驗以諾麗葉片為外植體，基于課題組諾麗葉片愈傷組織誘導方法建立了穩定的諾麗葉片細胞懸浮體系。實驗中諾麗葉片細胞懸浮培養的最優培養基為：MS+2.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。在該培養基中進行懸浮培養時懸浮細胞比生長速率為0.0753 d-1；實驗中最佳接種量為60 g/L，此時細胞生長速率達到最大；對細胞懸浮培養過程中各個指標的監測結果表明最佳繼代周期為22-26 d；實驗最終形成的穩定細胞懸浮培養液的細胞存活率為77.9%。

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