基于CRISPR/Cas9系統構建FOXA2表達示蹤體系

程浩杰 張振旺 譚桂湘 劉昱翔 卜會銅 譚擁軍

（湖南大學生物學院，長沙 410082）

2002年，Jansen等［1，2］首次定義了存在于細菌或古細菌中的抵御噬菌體入侵感染的CRISPR/Cas 系統。該系統由成簇規律間隔短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）結構，以及CRISPR相關的蛋白 質（CRSPR-associated protein，Cas9） 組 成［3，4］。CRISPR/Cas9系統大體分為三個類型，其中的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統僅需一種Cas9蛋白就能獨立對靶DNA有效切割［5］。該系統依賴質粒轉錄的一段單鏈向導RNA（single guide RNA，sgRNA）和其序列互補的靶DNA形成RNA-DNA復合物來決定CRISPR/Cas9核酸酶特異性［6］。由于該系統設計簡單，僅需完成一個克隆改變Cas9質粒的小段gRNA前序列即可特異性靶向切割，并且適用范圍廣闊，目前已有報道在動物［7-8］、植物［9-11］、微生物［12-13］和病毒［14-15］等都具有顯著的切割活性。該系統靶向切割細胞基因組后，細胞利用自身同源性定向修復（Homology directed repair，HDR）機制實現帶有同源臂的外源序列插入，是目前染色質定向改造主要方式之一。

基因 FOXA2［16］，曾用名是 HNF3β，定位于人染色體中20p11，全長45 kb，包含3個外顯子以及兩個內含子。其蛋白長度為457個氨基酸。FOXA2蛋白屬于叉頭框（Fox）家族的成員。因該家族蛋白具有一組高度保守的翼狀螺旋區域，主要特征是作為轉錄因子作用于DNA結合區域，所以又稱為轉錄因子FOXA2。Fox家族蛋白最先被發現于胚胎發育的進程中，深入研究發現Fox家族蛋白在免疫調節，周期調控等多個生理過程中發揮著重要的作用。轉錄因子之一的FOXA2近年來被發現與能量代謝、胰腺發育、癌癥與上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）等都有緊密的關系［17，18］。

完成基因FOXA2的內源性示蹤且不干擾基因本身的轉錄翻譯與蛋白質修飾，是一種很好的追蹤FOXA2基因表達開啟與關閉的方法。對于尋找FOXA2基因的通路相關基因、互作蛋白、潛在靶向藥物與抑制劑等都有很好的前景。在FOXA2的獨立開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）后，我們選擇在該基因第3個外顯子的蛋白質編碼區（Coding sequence，CDS）后插入綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）EGFP Donor（IRES+EGFP Sequences）序列。內部核糖體進入位點序列（Internal ribosome entry site，IRES）功能是招募核糖體對后面EGFP mRNA進行翻譯。本研究通過探索新型基因編輯CRISPR/Cas9的技術方法，實現對生物基因序列的高效編輯；通過構建基因FOXA2的綠色熒光蛋白示蹤體系，為實現與FOXA2相關的代謝、腫瘤、免疫等深入研究提供便捷有效的材料工具。

1 材料與方法

1.1 材料

CRISPR/Cas9真核表達載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（Addgene plasmid # 42230）；HEK293T細胞購自中科院典藏細胞庫、乳腺癌MCF-7細胞購自TACC；BbsI、XbaI、EcoR I限制性內切酶和T4連接酶購自Thermo公司；DMEM培養基購于GIBCO公司；胎牛血清（FBS）為Hyclone公司產品；Anti-FOXA2（ab60721）、Anti-β-actin（HRP）（ab49900）抗體購自abcam公司；Anti-Mouse（HRP）（Catalog170-6516） 購 自 BIO-RAD公 司；Anti-GFP（AF1483）、Anti-Rabbit（HRP）（A0208）購自Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 Cas9/gRNA靶位點設計以及真核表達載體的構建 根據真核表達載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9識別的前間區序列鄰近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM） 位 點 NGG， 質粒表達的gRNA特異性互補識別PAM位點及其上游20 bp核酸序列。Cas9核酸酶在PAM位點上游第3位和第4位堿基間切開以形成平末端切口。例如5'-NNNNNNNNNNNNNNNNN ▲ NNNNGG-3'。gRNA靶位點的選擇參考麻省理工學院在線設計網站http://crispr.mit.edu/，選取在線網站Score較高的序列。經HEK293T細胞中靶向位點活性檢測，最終確定靶向位點，位于人染色體20p11，FOXA2基因第3個外顯子中，CDS區后（圖1）。

用BbsI酶切表達載體pX330-U6-Chimeric_BBCBh-hSpCas9，以求表達載體質粒線性化。結合BbsI酶切后粘性末端堿基，設計靶向gRNA序列克隆引物：Cas9-FOXA2-F，Cas9-FOXA2-R（帶下劃線為粘性末端序列堿基）。將兩條引物梯度退火至使雙鏈互補結合。T4連接酶連接上述互補序列與已線性化的表達載體（圖2-B）。轉化大腸桿菌感受態DH5α涂板，挑取單菌落，質粒小提。表達載體測序鑒定。測序引物為Cas9-U6-F。示蹤核酸序列供體DNA片段 EGFP Donor引 物 ：Donor-F，Donor-R。Donor引物中帶下劃線為20 bp同源臂序列（表1）。

表1 載體構建及測序引物

圖1 CRISPR/Cas9靶向FOXA2插入IRES+EGFP

1.2.2 細胞轉染及陽性細胞分選 取對數生長期的MCF-7細胞，傳代至六孔板，細胞生長至鋪板70%。采用Lipofectamine 2000轉染靶向FOXA2基因的真核表達質粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（簡寫 為 Cas9-FOXA2）3 μg和 DNA 片 段 EGFP Donor 500 ng，陰性對照組轉染空靶表達質粒Cas9-NG 3 μg及DNA片段EGFP Donor 500 ng。用含10%的FBS和1%雙抗（工作濃度100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素）的DMEM完全培養基，于37℃、5%濃度CO2、細胞培養箱培養。48 h后汞燈下觀察細胞熒光，拍照，并以綠色熒光為標志物，取陰性對照組做陰性參考進行流式細胞熒光分選技術（Fluorescence activated Cell Sorting，FACS）分選。以單孔單細胞為標準，梯度有限稀釋分選后的細胞至96孔板。同上培養條件繼續培養被編輯的單克隆細胞至細胞適當密度，傳代富集。

1.2.3 基因組PCR鑒定 于基因組序列靶向切口上游76 bp（引物末端堿基開始至切口處）設計引物T-U，切口下游62 bp（切口處至引物前端）設計引物T-D。理論上編輯成功的細胞檢測PCR片段長度為1 504 bp。引物序列信息，見表2。取FACS分選、富集的單克隆細胞提取基因組DNA。以不同單克隆細胞基因組DNA為模板，上述引物T-U和T-D，進行聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）。鑒定引物位點見圖1。

表2 基因組PCR引物

1.2.4 示蹤體系的驗證 相較于正常細胞，被成功編輯的細胞MCF-7 KI-EGFP，理論上在細胞內具有示蹤FOXA2基因開啟或關閉的能力。腫瘤細胞的EMT是腫瘤細胞喪失上皮表型至獲得間質表型并同時增強細胞遷移和侵襲能力的過程，此過程重要的調控基因FOXA2會伴隨著細胞上皮型至間質型的轉化表達量逐漸下降甚至部分關閉。表皮細胞生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）具有誘導腫瘤上皮型細胞向腫瘤間質型細胞轉化的作用。因此我們設計使用EGF誘導編輯鑒定的上皮表型單克隆細胞株MCF-7 KI-EGFP來驗證示蹤體系。

細胞內轉錄水平（mRNA expression levels）驗證基因FOXA2示蹤體系。胰酶消化FACS分選、富集的單克隆細胞，并提取細胞總RNA。采用逆轉錄方法，將總RNA逆轉錄為cDNA再進行RT-PCR檢測。測定對照組及實驗組中細胞FOXA2表達量差異。

蛋白質印跡法（Western blot）驗證基因FOXA2示蹤體系。胰酶消化FACS分選、富集的單克隆細胞，并提取細胞總蛋白。正常MCF-7細胞總蛋白作為陰性對照。對照組和實驗組上樣相同蛋白量約30 μg，通過檢測細胞骨架蛋白β-actin 表達量差異確定上樣平衡。測定對照組，實驗組細胞總蛋白中FOXA2蛋白的表達量差異。

2 結果

2.1 表達載體以及同源重組片段的克隆、鑒定

真核表達載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBhhSpCas9原始載體的酶切表明，被限制性核酸內切酶BbsI線性化的表達載體呈現一條8 506 bp的單鏈，被限制性核酸內切酶XbaI、EcoR I雙酶切后呈現5 095 bp和3 411 bp雙片段（圖2-A）。靶向FOXA2的真核表達載體質粒設計（圖2-B）。測序結果表明，靶向FOXA2基因的Cas9-FOXA2克隆成功。同源重組片段EGFP Donor的克隆及純化（圖2-C）。

圖2 靶向FOXA2質粒和EGFP Donor的克隆及鑒定

2.2 靶向FOXA2基因座及同源性定向修復插入報告基因

根據實驗目的，結合靶位點設計網站篩選出的靶向位點，在FOXA2第三號外顯子中CDs區后插入綠色熒光蛋白報告基因（圖1）。在細胞面積鋪板70%且處于對數生長期的MCF-7細胞中脂質體轉染法轉染Cas9-FOXA2表達質粒和EGFP Donor報告基因片段。陰性對照組轉染pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（Cas9-NG）原始質粒載體和EGFP Donor報告基因片段。48 h后觀察綠色熒光，經FACS分選，傳代后的混合細胞集群熒光顯著增多（圖3）。根據熒光細胞數量占全細胞比例統計，MCF-7細胞轉染效率＞20%。

圖3 在MCF-7細胞FOXA2基因中插入綠色熒光蛋白并流式分選富集

2.3 有限稀釋法富集單克隆MCF-7 KI-EGFP細胞及其鑒定

取FACS分選后的細胞，于96孔板梯度稀釋（圖4-A）。A1孔為分選后的混合細胞，從A1孔至H1孔依次梯度稀釋10倍；再從第1列至第12列，依次稀釋10倍。旋轉搖動96孔板致使單細胞停落于孔徑中央區域，并小心放置于細胞培養箱靜止培養。于細胞完全貼壁后開始分列前，統計具有單細胞的孔徑，做好標記。培養基添加雙抗并提高血清濃度至15%。等待細胞生長分裂，以求編輯的單克隆細胞的富集，觀察有綠色熒光的孔徑細胞，做好編號1 #至10 #。傳代擴培，至細胞數量增至1×106，取5×105細胞傳代擴培，剩余細胞提取基因組DNA。以上述基因組DNA為模板，KI位點前后引物T-U和T-D（見表2）擴增跨界片段（EGFP Donor片段及其前后部分基因組序列片段）（圖4-B），并純化該PCR序列，測序結果顯示1 #單克隆細胞于靶位點發生有效同源重組。

圖4 FACS分選的陽性細胞梯度有限稀釋及單細胞基因組PCR鑒定

2.4 MCF-7-KI-EGFP細胞FOXA2基因示蹤體系的驗證

取第1代、第3代、第10代凍存的編輯成功的細胞株，復蘇。拍照熒光圖及明場圖，觀察細胞熒光穩定性。結果（圖5）顯示，綠色熒光傳代具有相對的穩定性，綠色熒光蛋白表達示蹤FOXA2具有準確相關性。

圖5 基因編輯細胞傳代穩定性及誘導驗證

取正常MCF-7細胞傳代鋪板60 mm盤，2盤，作為對照組。鑒定成功的第1代單克隆MCF-7 KIEGFP細胞1 # 傳代鋪板60 mm盤，4盤，為實驗組。傳代密度為50%。待細胞融合度80%，對單克隆MCF-7 KI-EGFP 1 #細胞2盤，進行EGF誘導處理。其余不做處理。EGF工作濃度為100 ng/ml。誘導時間72 h。

MCF-7 KI-EGFP單克隆細胞FOXA2轉錄水平驗證。收取對照細胞MCF-7、MCF-7 KI-EGFP 1 #及EGF誘導MCF-7 KI-EGFP 1 #三盤細胞，提取總RNA并逆轉錄為cDNA，進行RT-PCR檢測。檢測結果（圖5-B）顯示，相較于正常MCF-7細胞，編輯的單克隆細胞1 #，FOXA2基因mRNA表達量有明顯上調；相較于對照組MCF-7細胞，1 #細胞在EGF誘導處理后，FOXA2基因mRNA表達量明顯下調。

MCF-7-KI-EGFP單克隆細胞FOXA2基因翻譯水平驗證。收取對照組MCF-7、MCF-7 KI-EGFP 1 #以及EGF誘導的MCF-7 KI-EGFP 1 #三盤細胞，并提取總蛋白，進行蛋白質免疫印跡實驗。數據（圖5-C）顯示，相較于正常MCF-7細胞，單克隆細胞MCF-7 KI-EGFP 1 #，具有明顯的FOXA2蛋白表達上調趨勢；EGF誘導處理的MCF-7 KI-EGFP 1 #細胞，相較于正常MCF-7細胞，FOXA2蛋白表達下調；相較于未處理的1 #細胞，EGF誘導處理的1 #細胞綠色熒光蛋白表達明顯減少。

3 討論

FOXA2作為分化因子，在胚胎細胞向肝細胞特定分化中具有重要作用［19，20］；在調節肝脂質代謝過程中，Foxa2受胰島素和胰高血糖素的誘導調節，而被AKT信號磷酸化出核，P300乙酰化或HDACs/Sirt1去乙酰化，從而行使轉錄調節下游基因功能［21］；在乳腺癌、肺腺癌等疾病中，FOXA2激活細胞間粘附因子E-cadherin的轉錄表達，并且抑制ZEB2等實現抑制腫瘤EMT進程［17，18］。實現基因FOXA2的示蹤，對于上下游通路基因研究、疾病模型模擬、腫瘤發生發展研究具有重要的意義。本研究在乳腺癌細胞系MCF-7中實現對基因FOXA2的示蹤，旨在實現腫瘤相關信號通路發生發展過程的探索。

基因編輯CRISPR/Cas9技術，是近十年快速發展起來的靶向核酸新型技術，作為核酸酶，并經人工gRNA改造后理論上可以靶向切割任意匹配核酸序列。基因編輯前期發展方向，多是圍繞特定基因修飾細胞株及動物轉基因模型建立展開。隨著研究深入，技術進步目前已實現在臨床應用于急性淋巴白血病、肺癌等人體T淋巴細胞改造［22］。

在乳腺癌上皮表型MCF-7細胞中，靶向該細胞特定基因非編碼基因組區域研究基因區域性功能顯示其有效和便捷性［23］。且MCF-7細胞對藥篩、誘導等具有很好的響應性，是合適的乳腺腔管型腫瘤研究模型，因此我們選取MCF-7作為靶向研究細胞株。在挑選具有高SgRNA活性靶向位點階段，我們根據網站http://crispr.mit.edu/篩選出4個高分位點，克隆出4個位點的靶向載體并進行HEK293T細胞的轉染、靶向區域的PCR以及T7E1核酸錯配內切酶的鑒定，來確定Cas9靶向載體在293T細胞的切割效率，并選取靶向切割活性最高的SgRNA位點。在基因FOXA2蛋白質編碼區后插入IRES+EGFP序列且不破壞FOXA2終止密碼子，因此FOXA2 的CDS區綠色熒光蛋白核酸序列共處一個基因座，共用一套轉錄增強區域和抑制區域，保證EGFP和FOXA2轉錄水平同步進行。和IRES 序列作為招募核糖體的內部核糖體進入位點序列（Internal ribosome entry site，IRES），幫助EGFP綠色熒光蛋白序列結合核糖體從而開始翻譯進程，其自身攜帶的轉錄起始和終止密碼子保證蛋白質完整結構的正常翻譯。利用該技術實現對特定基因內源性表達示蹤，具有其它外源示蹤體系無法相比的高效和準確性，且原理簡單，技術通用性強。該類細胞株在研究中方便直觀，可實現動態性的檢測活體細胞或組織中基因表達，這是傳統技術研究方法的空白區。

4 結論

本研究利用基因編輯CRISPR/Cas9技術在乳腺癌細胞系MCF-7中定點插入綠色熒光蛋白序列實現對FOXA2的示蹤。實驗從靶向位點序列的篩選驗證、材料構建、細胞株制備及分選鑒定等多方面詳細描述了研究過程。實驗結果表明，經細胞模型EGF誘導驗證，綠色熒光蛋白表達水平能夠有效示蹤FOXA2表達開啟和關閉。

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