豬圓環病毒2型PCR檢測方法的建立

李婧雅 王德全 袁秀芳 黃華榮

（1.杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江 杭州 310000；2.浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310000）

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環病毒科圓環病毒屬，病毒粒子大小為14～25nm，平均直徑17nm，呈對稱的二十面體，無囊膜，是目前已知最小的動物病毒之一。根據其致病性、抗原性或基因組差異分為無致病性的豬圓環病毒1型（PCV1）和有致病性的豬圓環病毒2型（PCV2），前者廣泛存在于豬群當中。PCV2是仔豬多系統衰竭綜合征（PostweaningMultisyst emicWastingSyndrome，PMWS），豬皮炎、豬增生性壞死性間質性肺炎與腎病綜合征（PNDS）的主要病原，PMWS是最早被認識和確認的由PCV2感染所致的疾病。常見的PMWS主要發生在5～16周齡的豬，極少感染乳豬。一般于斷奶后2～3d開始發病。PMWS主要以漸進性消瘦、生長遲緩、厭食、精神沉郁、行動遲緩、皮膚蒼白、被毛蓬亂、呼吸困難，咳嗽為特征，急性發病豬群中，病死率可達10%，但并發或繼發細菌或病毒感染的病死率可達25%以上。血清學調查表明，PCV2在世界范圍內流行，給生豬飼養業造成了嚴重的危害。該病受到各國農業部門的高度重視。近年來豬圓環病毒2型已成為國內外獸醫領域的研究熱點之一,國內外對此已有很多報道。例如胡曉華等通過間接ELISA方法在安徽、廣東、廣西等可疑豬群中檢測PCV2陽性率分別為100%、48.39%、100%。本研究擬通過Genebank數據庫中序列比對法設計特異性引物，并對各項參數進行合理優化，建立一種穩定、靈敏的針對PMWS檢測的PCR方法。利用這一方法對來自浙江省不同地區規模豬場疑似患PMWS仔豬的病料進行PCR檢測應用，最終為浙江省生豬飼養業的PMWS流行病學提供數據參考。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料取自浙江地區帶有典型PMWS癥狀病豬的淋巴結、脾臟、肺臟等臟器，-80℃保存備用。確診的豬偽狂犬病病料（PRV）、豬細小病毒病病料（PPV）作為特異性檢測的對照。

TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCR純合試劑盒、病毒DNA提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。實驗所需大腸桿菌DH5α、pMD18-T載體購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計和合成

通過比對GenBank數據庫中15種PCV2病毒株的基因共有特征及PCV2 ORF2的核苷酸序列，應用Primer Premier軟件分別設計了一對特異性引物，該對引物能夠特異擴增PCV2中的469bp序列,而同屬的PCV1核酸序列則不能擴增出條帶。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

上游引物序列為P1：

5’-TCCGCGGGCTGGCTGAACT-3’

下游引物序列為P2：

5’-GGGGGAAAGGGTGACGAACTGG-3’

1.2.2 病料處理及病毒DNA提取

新鮮組織用剪刀剪去脂肪、肌腱等,按1∶5加入PBS液,無菌研磨成勻漿，-70℃凍融3次，4℃，12000rpm離心5min, 取上清。用病毒DNA提取試劑盒提取病毒DNA，最后洗脫于50μlTE緩沖液中，于-20 ℃保存。

1.2.3 ORF2基因的PCR擴增

PCR擴增的反應體系為50.0μL，其中：10×Buffer 5.0μL、2.0mM MgCl2 4.0μL、200μM dNTPs 5.0μL、0.1μM PCV2-P12.0μL、0.1μM PCV2-P22.0μL、rTaq DNA ploymerase 0.5μL、DNA 模板 2.0μL。補足 ddH2O 至 50μL?；靹蚝笾门cBioradT100 PCR儀，擴增的反應程序為：95℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，36 個循環；最后72℃延伸10min，4℃保存備用。最終PCR產物用1.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.4 PCR條件優化

以病料提取的病毒DNA為模板,設計不同復性溫度（52℃-60℃，間隔1℃）、不同引物濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、及1.2μmol/L），分別以上述的反應體系和反應程序進行PCR擴增，比較最終產物的擴增效率。

1.2.5 敏感性測定

用紫外分光光度計測定PCV2 DNA模板的濃度，初始病毒DNA模板濃度約為10ng/μL，用TE緩沖液將混合模板作1∶10系列稀釋（10-0～10-6），每個稀釋度取2μl作為模板，進行PCR擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測該PCR方法的敏感性。

1.2.6 特異性測定

常規提取非靶DNA，包括PCV1、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）基因組DNA，設置空白對照,用PCV2特異性引物及上述方法進行PCR擴增、電泳，檢測該方法的特異性。

1.2.7 重復性檢驗

用上述建立的PCR反應體系和反應程序對3份不同的PCV2陽性病料DNA分別進行6次重復性試驗，檢驗該方法的重復性和穩定性。

1.2.8 PCR產物的克隆及測序

將病料擴增所得的PCR產物基因片段連接到pUC18載體中，轉化DH5α大腸桿菌，用含50μg/mL氨芐青霉素的LB平板培養基進行篩選，37℃培養16h后挑取單個白色菌落，置于含50μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養基中振蕩培養，擴增提取出的質粒提取送上海生物工程有限公司進行測序。測序結果利用NCBI網站的數據庫進行比對。

1.2.9 浙江地區PCV2的分子流行病學調查

應用優化建立好的PCR方法對來自浙江不同地區142份疑似PCV2感染病豬進行批量檢測，確定最終的感染率。

2 試驗結果

2.1 PCV2基因的PCR擴增

以臨床病料提取DNA作為模板，經過PCR擴增、電泳后，可見469bp的特異性條帶。結果如圖1。

圖1 PCV2的PCR擴增結果

2.2 PCR條件的優化

經過在52～60℃溫度梯度下擴增，結果為在所有溫度條件下，均擴增出了目的片段，但52～55℃出現少許非特異性帶。以57℃擴增時產物得率最高，故將此PCR反應的退火穩定設置在57℃。

在引物濃度的優化實驗中，0.6-1.0μmol/L濃度的引物均可以擴增出469bp大小的目的片段。最終人們確定下來的最佳反應體系為10×buffer 2μL，dNTP（各10mmol/L）0.5μL，Pl、P2 各 0.5μL，Taq DNA 聚 合 酶0.2μL，DNA 模板 2μL，無菌 ddH2O添加至20μL，采用以下反應程序：94℃預變性5min；94℃30s，57℃30s，72℃1min,35次循環；最后72℃延伸5min。

圖2 PCV2敏感性檢測結果

2.3 敏感性測定

病料模板DNA經過連續6次的10倍稀釋,在上述優化后的條件下擴增，圖2結果顯示10-5倍稀釋后（2pgDNA模板）仍能擴增出預期大小片段，表明其敏感度達到0.1pg/ul濃度，證明該方法具有極高的靈敏度。

2.4 特異性測定

用我們設計的PCV2特異性引物擴增PRV、PPV和PCV1病料模板DNA，電泳后不能任何條帶，說明該PCR方法僅對PCV2是特異的。

圖3 PCV2特異性檢測結果

2.5 重復性檢測

PCR擴增后凝膠電泳結果表明，3個樣品6次重復均檢測出陽性條帶,證明該方法具有良好的可重復性和穩定性。

2.6 測序

PCR產物經克隆測序后，在NCBI數據庫中比對分析表明，擴增得到的DNA片段與Genbank數據庫收錄的29種PCV2核酸片段的同源性都在96%以上。證實擴增的條帶就是PCV2的核酸序列。

2.7 浙江地區流行情況調查

采樣的142份病料中，經我們的PCR檢測后有80份為陽性，陽性率達56.3%。說明PCV2病毒已經廣泛存在于浙江省各大豬場，這對生豬飼養業的疾病防控提出了挑戰。

3 討論

傳統的PCV2檢測方法有酶聯免疫吸附實驗（ELISA）、原位核酸雜交（ISH）和免疫組化實驗（IHC）等方法，這些方法操作復雜、檢測時間長、存在非特異性反應和敏感度低等缺點，難以滿足生豬養殖業疾病防控快速響應的需求。隨著分子生物學的發展，PCR檢測方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、檢測快捷等特點，已經廣泛應用于快速高效地對細菌和病毒等病原體的檢測。成功的PCR反應既要高效，又要特異，其關鍵在于引物的設計。一對好的引物設計就是在擴增效率和特異性之間尋求平衡。本研究引物設計的依據是通過比對Genebank收錄的大量PCV2核苷酸序列，在其保守區域內尋找引物位點。最終我們設計出的引物可以特異地擴增出PCV2的相應條帶，而對PRV，PPV和PCV1等病毒基因組模板不能擴增出條帶,說明本方法用來作為診斷PCV2感染是有效可行的。該方法從核酸的制備到檢測出結果約需4h，大大縮短了檢測時間，可用于疑似PCV2感染病豬的快速診斷及分子流行病學調查，為規?；i場有效診斷防治豬圓環病毒病提供了參考依據。