HMGB2啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建、活性驗(yàn)證及與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)

王飛， 馮奇， 秦杰， 李婉， 盧春

(南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系， 江蘇 南京 211166)

高遷移率族蛋白(high mobility group，HMG)于1973年被發(fā)現(xiàn)，因其特殊的溶解性和在SDS-PAGE中的高遷移率而得名。HMG蛋白是含量?jī)H次于組蛋白的染色質(zhì)蛋白，分布在細(xì)胞核內(nèi)，主要行使調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能；此外，它還參與轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重組和DNA修復(fù)等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[1-2]。HMG蛋白根據(jù)其同源性可進(jìn)一步分為HMGA、HMGB、HMGN 3個(gè)家族[3]，其中HMGB家族的HMGB1和HMGB2具有很高的同源性。研究顯示，HMGB1蛋白參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)多種腫瘤形成與血管生成[4-5]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)HMGB2在乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤和肝癌[6]等多種腫瘤中呈高表達(dá)，且在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用[7-9]。啟動(dòng)子是具有調(diào)節(jié)功能的DNA序列，位于基因5′端上游，具有可以與反式作用因子結(jié)合的順式作用元件結(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子就像“開(kāi)關(guān)”，能夠活化RNA聚合酶并使之與模板DNA準(zhǔn)確結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄，其本身并不影響基因的表達(dá)，而是通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而控制基因轉(zhuǎn)錄起始[10-14]。

本研究擬構(gòu)建含有HMGB2啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行功能活性鑒定。同時(shí)，通過(guò)軟件分析預(yù)測(cè)可能與HMGB2啟動(dòng)子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步研究調(diào)控HMGB2基因轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞

pGL3-Basic、pCMV6-Entry-C-Flag、pCMV6-Entry-C-Flag-p53和海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pRL-TK為本實(shí)驗(yàn)室保存。本實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞包括人胚腎上皮細(xì)胞(293T細(xì)胞)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，分別培養(yǎng)在含有10%和20%血清(美國(guó)Gibco公司)的DMEM(美國(guó)Gibco公司)中；培養(yǎng)基中含10 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，所有細(xì)胞均培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用的PCR引物由南京擎科生物科技有限公司合成；PCR高保真酶(Fanta酶)購(gòu)自南京諾唯贊科技有限公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒及感受態(tài)大腸埃希菌DH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒及凝膠純化試劑盒(美國(guó)Omega公司)；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和KpnⅠ(日本TaKaRa公司)；T4DNA連接酶(美國(guó)Thermo Scientific公司)；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)；Dual-Glo Luciferase Assay System(美國(guó)Promega公司)；p53抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 全基因組DNA的提取 提取HUVECs的全基因組DNA作為HMGB2啟動(dòng)子區(qū)域序列PCR擴(kuò)增的模板。首先，選取匯合度為80%的HUVECs，經(jīng)胰酶消化后，用含有20%血清的完全DMEM終止消化，室溫800×g離心5 min，棄上清液；PBS重懸后再次離心棄上清液，根據(jù)血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取HUVECs基因組DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增HMGB2啟動(dòng)子序列 在NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢HMGB2啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。上游引物：5′-CGGGGTACCACCAAAGAGCATAGTCTTAACATGTGCCAA-3′(下劃線部分為保護(hù)性堿基，斜體部分為KpnⅠ限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列)，下游引物：5′-CCGCTCGAGCC-CCAAATGCCGCTCGC-3′(下劃線部分為保護(hù)性堿基，斜體部分為XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列)。以提取的HUVECs全基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增HMGB2啟動(dòng)子序列，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物條帶在正確的位置后，進(jìn)行切膠回收純化。

1.3.3 pGL3-HMGB2-promoter質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將上述切膠回收產(chǎn)物和pGL3-Basic質(zhì)粒分別用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收純化和T4連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于具有氨芐西林抗性的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日，隨機(jī)挑選單克隆菌落于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)、大量擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，同時(shí)，測(cè)定核酸序列，并利用APE軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

1.3.4 蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p53對(duì)HMGB2啟動(dòng)子活性的影響 將293T細(xì)胞接種在48孔板中，次日，使用LipofectamineTM2000將pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒、pGL3-Basic空載體分別與pCMV6-Entry-C-Flag-p53、pCMV6-Entry-C-Flag以及內(nèi)參pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，pCMV6-Entry-C-Flag-p53質(zhì)粒與空載質(zhì)粒pCMV6-Entry-C-Flag以及pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒與其空載質(zhì)粒pGL3-Basic的質(zhì)量比為4 ∶1。24 h后，根據(jù)Dual-Glo Luciferase Assay System試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)相應(yīng)組別的熒光素酶活性，每組相對(duì)熒光素酶活性的值等于每組中每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶檢測(cè)值比值的平均值。

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)p53蛋白的表達(dá) 收集“1.3.4”中重組質(zhì)粒pGL3-HMGB2-promoter分別共轉(zhuǎn)染pCMV6-Entry-C-Flag-p53和pCMV6-Entry-C-Flag的293T細(xì)胞，提取總蛋白，取100 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜；經(jīng)5%脫脂牛奶封閉1 h后，將PVDF膜孵育在p53和內(nèi)參GAPDH的一抗中(稀釋比為1 ∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜3次，每次5 min。用相應(yīng)的二抗37 ℃孵育1 h后(稀釋比為1 ∶10 000)；TBST洗膜3次，每次5 min，于化學(xué)發(fā)光儀下顯影。

1.3.6 與HMGB2啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè) 將HMGB2啟動(dòng)子序列輸入在線軟件PROMO(http:∥alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)中，根據(jù)網(wǎng)站提示進(jìn)行操作，輸出可以與HMGB2啟動(dòng)子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

通過(guò)查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)資料，獲得HMGB2啟動(dòng)子的范圍，為HMGB2 mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1 379 bp到下游+292 bp的位置。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以HUVECs全基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段約1 684 bp，與目標(biāo)DNA長(zhǎng)度一致(圖1)。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：HMGB2基因啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物

對(duì)pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果可見(jiàn)2條特異性片段，分別約為4 817 bp(載體片段)和1 684 bp(HMGB2啟動(dòng)子片段，圖2a)。重組質(zhì)粒測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，插入的HMGB2啟動(dòng)子序列與理論序列一致(圖2b)，表明pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：重組質(zhì)粒pGL3-HMGB2-promoter雙酶切產(chǎn)物;A: 重組質(zhì)粒pGL3-HMGB2-promoter的雙酶切鑒定；B: 重組質(zhì)粒部分測(cè)序結(jié)果

2.2 pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)?；钚缘尿?yàn)證

蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pGL3-HMGB2-promoter報(bào)告質(zhì)粒的活性明顯高于pGL3-Basic對(duì)照組(t=4.587，P<0.01，圖3)，表明pGL3-HMGB2-promoter質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)錄活性。

a：P<0.01，與pGL3-Basic比較

2.3 p53對(duì)HMGB2啟動(dòng)子活性的影響

免疫印跡結(jié)果證實(shí)，pGL3-HAGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag-p53共轉(zhuǎn)染組成功過(guò)表達(dá)p53；蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)p53的pGL3-HAGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag-p53共轉(zhuǎn)染組重組質(zhì)粒的蟲(chóng)熒光素酶活性明顯低于pGL3-HMGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag共轉(zhuǎn)染組(圖4)。由此進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pGL3-HMGB2-promoter報(bào)告質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)錄活性。

2.4 與HMGB2啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)

運(yùn)用在線軟件PROMO對(duì)HMGB2啟動(dòng)子區(qū)域(-1 379 bp～+292 bp)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)出72個(gè)可能與HMGB2啟動(dòng)子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，其中TFIID[16]、LEF-1[17-18]、POU2F2(Oct-2)[19]、NFI/CTF[20]、FOXP3[21]、STAT4[22]等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)(表1)。這些轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)為我們進(jìn)一步探索調(diào)控HMBG2表達(dá)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

表1 HMGB2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的部分預(yù)測(cè)結(jié)果

1：pCMV6-Entry-C-Flag; 2:pCMV6-Entry-C-Flag-p53

3 討論

先前的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB2可與雌激素受體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)分泌治療藥物對(duì)乳腺癌的治療作用，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展[9]。另外，HMGB2可以通過(guò)調(diào)控p53的表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存、侵襲能力以及對(duì)化療藥物的拮抗作用，從而促進(jìn)骨肉瘤、惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展[23-24]。另有研究表明，HMGB2可以促進(jìn)Oct4的小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)化，從而抑制其被磷酸化降解，進(jìn)一步激活A(yù)KT通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[25]。

本研究擴(kuò)增了HMGB2啟動(dòng)子所在區(qū)域的DNA片段，成功構(gòu)建了含有HMGB2啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒。p53可通過(guò)結(jié)合HMGB2啟動(dòng)子區(qū)抑制其轉(zhuǎn)錄[15]，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的pGL3-HMGB2-promoter報(bào)告質(zhì)粒活性能夠被p53抑制，與之一致。該質(zhì)粒的構(gòu)建有助于尋找能夠與HMGB2啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)HMGB2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而闡明HMGB2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的具體分子機(jī)制。

通過(guò)在線軟件PROMO對(duì)HMGB2啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，獲得72個(gè)可能作用于HMGB2的轉(zhuǎn)錄因子，其中p53已被報(bào)道可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控HMGB2[15]。另外，預(yù)測(cè)結(jié)果中的許多轉(zhuǎn)錄因子可以與HMGB2直接結(jié)合，或者受HMGB2調(diào)控從而影響其行使轉(zhuǎn)錄功能。例如，HMGB2可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD-TFⅡA與其調(diào)控的目的基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合從而促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄[26]。HMGB2可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Lef-1的表達(dá)及其與β-catenin復(fù)合物的形成，進(jìn)而誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)[17-18]。HMGB2還可以通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Oct2的表達(dá)，抑制正常B淋巴細(xì)胞的分化、維持B淋巴瘤細(xì)胞的存活導(dǎo)致B淋巴瘤的發(fā)生[19, 27]。這些轉(zhuǎn)錄因子是否能夠調(diào)控HMGB2轉(zhuǎn)錄，目前尚不清楚。我們下一步將以這些可能作用于HMGB2啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子為基礎(chǔ)，探究其在HMGB2轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用，從而有助于闡明HMGB2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制。

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