E3泛素連接酶PARK2對人腦膠質瘤細胞侵襲與遷移能力的影響

吳玨 裘佳寅 許璐 李錦 陳寧 潘亭亭 田亞平

惡性腦膠質瘤是中樞神經系統最常見、死亡率最高的原發性腦腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%，嚴重威脅人類健康[1]。侵襲和遷移行為是膠質瘤細胞的重要特征，腦膠質瘤向正常腦組織周圍彌漫性、浸潤性生長，手術難以完全切除。因此，探索腦膠質瘤侵襲和遷移的分子機制，尋找其潛在的治療分子靶點將有重要臨床意義。PARK2基因編碼的蛋白是一種E3泛素連接酶，參與生物體內蛋白的泛素化修飾，并連接蛋白酶體降解系統，最初是作為常染色體隱性遺傳性少年型帕金森病的致病基因而被發現[2-5]。但它在膠質瘤細胞中侵襲遷移的生物學功能和可能的分子機制尚不明確。本研究通過在腦膠質瘤細胞中構建過表達PARK2細胞株，揭示PARK2影響腦膠質瘤細胞的侵襲和遷移作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

U138，A172，U251，U373，T98G細胞株均購于ATCC細胞庫；DMEM高糖培養基、胎牛血清、DMSO、胰酶等均購于Gibco；PARK2抗體購于CST公司； GAPDH抗體、二抗購于Santa Cruz公司；載體pBABE-puro購于Cell Biolabs Inc公司產品；Matrigel購于Corning公司；Transwell小室購于BD公司。

1.2 穩定過表達細胞株的構建

選用逆轉錄病毒載體pBABE-puro vector來構建PARK2-WT的穩定過表達細胞系。選擇狀態良好的細胞，將包裝好的逆轉錄病毒載體pBABE-puro-PARK2病毒液轉染到腦膠質瘤細胞中，感染24～48 h后嘌呤霉素篩選陽性克隆3 d，收集以上細胞株的蛋白，進行免疫印跡檢測PARK2在這些細胞中的蛋白的表達水平。

1.3 免疫印跡

RIPA蛋白裂解液裂解細胞后，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至硝酸纖維膜上；用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h；加入一抗（PARK2、EGFR和GAPDH稀釋倍數均為1：5 000），4℃過夜，TBST洗滌3次，每次15 min；分別加二抗（辣根過氧化物酶標記）室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次15 min；ECL顯色，醫用膠片顯影。

1.4 細胞劃痕試驗

消化細胞種6孔板，具體數量因細胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿，復孔重復；37℃孵育細胞過夜；第2天6孔板中加入2 ml無抗無血清的培養基37°C孵育細胞過夜；24 h后等細胞長滿后，用200 μl 槍頭在6孔板上劃一個十字，槍頭要垂直，不能傾斜，PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基；放入37度5% CO2培養箱培養，不同時間點拍照。

1.5 Transwell侵襲試驗

使用50 mg/l Matrigel 1：8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風干；制備細胞懸液前，細胞撤血清饑餓12 h；消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用PBS洗3遍，用含BSA的無血清培養基重懸；取細胞懸液200 μl加入Transwell小室；24孔板下室一般加入500 μl含FBS培養基，常規培養12～48 h；用結晶紫染色，洗脫液洗脫，酶標儀上570 nm 測其OD值。

1.6 統計學分析

各實驗獨立重復至少3次以上。實驗結果采用統計軟件SPSS13.0進行處理，兩組間比較采用兩樣本Student’s t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤細胞中構建過表達PARK2的穩定細胞株

為研究PARK2對人腦膠質瘤細胞侵襲與遷移能力的影響，我們在體外GBM細胞上分別利用慢病毒載體pCDH-CMV-MCSEF1-copGFP（過程參見材料和方法）上構建了PARK2過表達細胞穩定株，用于研究和觀察PARK2對GBM細胞生物學功能的影響。首先，我們確認PARK2在GBM細胞系的表達情況，我們發現A172和U138細胞中蛋白表達水平較高，U373、U251和T98G細胞蛋白表達都較低（圖1A）。然后，我們選擇在U251和T98G細胞中構建了過表達PARK2穩定株并通過Western-blot確定了細胞穩定株的效果（圖1B）。

圖1 腦膠質瘤細胞中PARK2的表達和穩定過表達株的蛋白驗證；A.PARK2在腦膠質瘤細胞中的表達情況；B.構建PARK2過表達穩定細胞株驗證

圖2 過表達PARK2對膠質瘤細胞遷移和侵襲能力的影響（P＜0.01）；A.劃痕實驗檢測過表達PARK2對膠質瘤細胞U251遷移能力的影響；B.Transwell 侵襲實驗檢測過表達PARK2對膠質瘤細胞U251和T98G侵襲能力的影響

2.2 PARK2影響腦膠質瘤細胞遷移和侵襲

我們采用劃痕實驗和Transwell invasion模型檢測PARK2對膠質瘤細胞遷移和侵襲能力的影響。過表達細胞株U251-PARK2穩定株進行劃痕實驗，經過劃痕后連續觀察，PARK2過表達組細胞向劃痕中央遷移的速度明顯減慢，在劃痕48 h后對照組的細胞已經接近匯合處，而PARK2過表達組仍有較寬的劃痕存在，與轉染空載體的對照組相比，過表達U251-PARK2的細胞遷移能力明顯低于對照組，如圖2所示，實驗重復三次且差異有統計學意義（P＜0.01）。接著，PARK2過表達的膠質瘤細胞U251和T98G穿過人工基底膜侵襲到小室底面的細胞相對于對照組明顯減少（圖2），實驗重復三次，差異有統計學意義（P＜0.01）。以上結果表明，過表達PARK2可以抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲能力。

3 討論

PARK2基因編碼的蛋白是一種E3泛素連接酶，參與生物體內蛋白的泛素化修飾，并連接蛋白酶體降解系統。目前研究發現PARK2的功能包括蛋白質反轉、應激反應、體內穩態、異源吞噬、新陳代謝、細胞生長和生存等[6-10]。PARK2除廣泛存在于人類正常組織中，在多種腫瘤組織，如肺癌、胃癌、宮頸癌、結腸癌、皮膚黑色素瘤等中存在體細胞PARK2失活的參與；PARK2缺失的小鼠可增加腫瘤發生的易感性；敲低PARK2可促進膠質瘤細胞的增殖和腫瘤形成能力，而過表達PARK2可減少在體外或體內各種組織起源的癌細胞的增長，以上都顯著表明PARK2的腫瘤抑制作用[11-14]。但是PARK2在腫瘤中侵襲和轉移的行為還未曾明確。因此，為進一步研究PARK2在腫瘤中的生物學功能，我們研究選擇了五種腦膠質瘤的細胞系檢測PARK2的蛋白表達情況，發現了U373、U251、T98G表達量明顯低于U138和A172。于是我們選擇了U251和T98G細胞構建PARK2野生型的過表達株用于PARK2在膠質瘤細胞中生物學功能的研究。通過在膠質瘤細胞U251和T98G上過表達PARK2觀察其對膠質瘤細胞侵襲和轉移能力的影響，并尋找可能的機制。通過細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗，我們發現上調PARK2后細胞的侵襲和遷移能力明顯下降。因此，我們發現PARK2在膠質瘤的侵襲和遷移中扮演著重要的角色，是腦膠質瘤侵襲與遷移的重要因子。

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