紅景天苷對對乙酰氨基酚誘導肝損傷模型小鼠Keap1-Nrf2信號通路的影響Δ

左瑋，張波，梅丹（中國醫學科學院北京協和醫院藥劑科/協和轉化醫學中心，北京100730）

對乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）又名撲熱息痛，是一種常用的解熱鎮痛藥，于1893年首次合成，1960年作為非處方藥（OTC），是公認推薦劑量安全有效、胃腸道不良反應較少的解熱鎮痛藥[1]，但其會導致肝損傷，這成為限制其臨床應用的主要問題之一，至今尚未得到解決。紅景天（Rhodiola roseaL.）為景天科多年生草木或灌木植物，藥用歷史悠久。紅景天苷（Salidroside，SALD）是紅景天經現代化學分離提取后的主要活性成分，具有抗疲勞、抗衰老、抗炎、鎮痛、調節免疫等多種藥理作用[2-3]。戴博等[4]發現高山紅景天對APAP誘導的小鼠肝損傷具有保護作用，但其作用機制并不清楚。氧化應激與肝疾病的發生息息相關，APAP代謝過程中產生的自由基、親電體和活性氧自由基（ROS）可以引起脂質過氧化，最終導致肝損傷。無論是酒精性或者非酒精性脂肪肝疾病，還是藥物或者其他化合物導致的肝損傷中，Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）-核轉錄因子NF-E2相關因子（Nrf2）信號通路在調節氧化應激的過程中都起到了重要作用[5]。本研究用APAP誘導小鼠肝損傷模型，觀察SALD抗藥物性肝損傷的作用，并從Keap1-Nrf2信號通路出發對其作用機制進行探討，為闡明SALD對APAP所致肝損傷的保護作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BX51型顯微鏡（德國Leica公司）；2K16型臺式低溫離心機（德國Sigma公司）；DYY-7C型電泳轉移裝置（北京六一儀器廠）；TBA-40FR型全自動生化分析儀（日本Toshiba公司）。

1.2 藥品與試劑

乙酰半胱氨酸（NAC）標準品（批號：1009005，純度：98%）、SALD標準品（批號：05410590，純度：99%）均購自美國Sigma公司；APAP標準品（上海麥克林生化科技有限公司，批號：103-90-2，純度：99%）；丙氨酸轉氨酶（ALT，批號：2014-2401158）、天冬氨酸轉氨酶（AST，批號：2014-2401157）、堿性磷酸酶（ALP，批號：2014-2401128）、乳酸脫氫酶（LDH，批號：2014-2401131）、胞漿胞核蛋白提取試劑盒以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔/羊抗小鼠二抗均購自中生北控生物科技有限公司；Nrf2、Keap1、血紅素氧合酶1（HO-1）、還原型輔酶/醌氧化還原酶1（NQO1）和谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCLC）、β-肌動蛋白（β-actin）、抗增殖性細胞核抗原（PCAN）抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.3 動物

C57BL/6小鼠60只，SPF級，♂，體質量23～25 g，由北京斯貝福實驗動物科學技術有限公司提供，實驗動物質量合格證號：SCXK（京）2011-0004。整個實驗過程遵循中國醫學科學院北京協和醫院動物福利倫理委員會要求。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常組、模型組、陽性組（150 mg/kg NAC）[6]和SALD低、中、高劑量組（100、200、300 mg/kg）[7-9]。各組小鼠均給予正常飼料，自由飲水。各給藥組小鼠按10 mL/kg灌胃相應藥物，給藥后1 h灌胃500 mg/kg的APAP；正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，其中模型組小鼠在給予生理鹽水后1 h灌胃500 mg/kg的APAP。每天給藥1次，連續給藥5 d。

2.2 血清生化指標檢測

末次給藥后禁食不禁水，9 h后對小鼠摘除眼球取血，將血樣于室溫下靜置120 min，然后以1 409×g離心10 min，常規分離血清，采用全自動生化分析儀測定小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量。

2.3 肝組織病理學觀察

取血后處死小鼠，取肝大葉同一部分組織，以3%蔗糖-多聚甲醛溶液（4%多聚甲醛配制）固定，常規制備石蠟切片（4 μm），脫蠟，水化。行蘇木精-伊紅（HE）染色，用自來水和蒸餾水依次洗滌浮色，75%鹽酸乙醇分化并用蒸餾水洗滌，封片，在顯微鏡下拍照觀察各組小鼠肝組織病理學變化。

2.4 肝組中Keap1-Nrf2信號通路相關蛋白檢測

采用Western blot法檢測小鼠肝組織中Nrf2、Keap1、NO-1、NQO1和GCLC蛋白表達。取各組小鼠（每組選4只）肝大葉同一部分組織，稱質量，放入預冷的組織裂解液中裂解30 min，然后將裂解組織收集到1.5 mL EP管中進行超聲勻漿，將組織勻漿于4℃條件下以13 400×g離心20 min，取上清（為全蛋白）。按照胞漿胞核蛋白提取試劑盒說明分別提取細胞質和細胞核蛋白，二喹啉甲酸法（BCA）進行蛋白定量。每組取50 g蛋白樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳對樣品進行分離。分離后進行轉膜、封閉，加入相應一抗（1∶1 000）后4℃孵育過夜，棄去一抗；TBST洗膜洗3次，加入二抗（1∶5 000），室溫搖床孵育2 h。加入增強化學發光液，采用成像軟件LAS3000 Image Reader拍照并保存圖像，Quantity one軟件進行圖片分析，計算條帶灰度值，以目的蛋白條帶條帶灰度值與內參（細胞核蛋白測定以PCAN為內參，細胞質蛋白測定以β-actin為內參）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2.5 統計學方法

采用SPSS 10.0軟件學進行統計分析。數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Turkey’s test法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清生化指標測定結果

與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量均不同程度減少，除SALD低劑量組小鼠血清中LDH含量減少不顯著外，其余各給藥組小鼠血清中各指標含量均顯著減少（P＜0.01），結果見表1。

表1 各組小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量測定結果（±s，n＝10，U/L）Tab 1 Content determination of ALT，AST，ALP and LDH in serum of mice in each group（±s，n＝10，U/L）

表1 各組小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量測定結果（±s，n＝10，U/L）Tab 1 Content determination of ALT，AST，ALP and LDH in serum of mice in each group（±s，n＝10，U/L）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別正常組模型組陽性組SALD低劑量組SALD中劑量組SALD高劑量組LDH 165.53±109.33 1 453.33±83.64＊＊451.36±85.64##1 241.86±89.32 501.27±94.47##857.13±96.64##ALT 51.33±66.46 649.34±66.46＊＊139.87±55.26##328.54±46.58##119.36±39.26##181.67±27.91##AST 26.52±111.31 800.65±100.42＊＊136.58±98.91##486.11±82.31##135.89±86.46##191.43±79.26##ALP 41.96±29.01 195.87±20.33＊＊84.92±19.05##86.79±23.01##81.46±24.46##124.52±30.61##

3.2 肝組織病理學觀察結果

正常組小鼠肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細胞正常。模型組小鼠肝小葉結構紊亂辨別不清，肝細胞嗜酸性壞死，在匯管區周圍肝細胞促生小脂肪滴（圖中箭頭所示）。各給藥組小鼠肝組織病理改變均不同程度好轉，其中SALD中劑量組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞壞死少見，偶見油滴出現。各組小鼠肝組織病理學觀察結果見圖1。

3.3 肝組織中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1和GCLC蛋白表達測定結果

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中Nrf2（細胞核內）、Keap1（細胞核內）、HO-1（細胞質中）、GCLC（細胞質中）蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，除陽性組小鼠肝組織中Nrf2（細胞核內）、Keap1（細胞核內）蛋白表達水平升高不顯著外，其余各組小鼠的其余各蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠肝組織中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1和GCLC蛋白表達測定的電泳圖見圖2，測定結果見表2。

圖1 各組小鼠肝組織病理學觀察結果（HE染色，×100）Fig 1 Pathohistological observation of liver tissue of mice in each group（HE staining，×100）

圖2 各組小鼠肝組織中Keap1-Nrf2信號通路相關蛋白表達測定的電泳圖Fig 2 Electrophorograms of determination of Keap1-Nrf2 signal pathway related protein in liver tissue of mice in each group

表2 各組小鼠肝組織中Keap1-Nrf2信號通路相關蛋白表達水平測定結果（±s，n＝4）Tab 2 Determination results of Keap1-Nrf2 signal pathway related protein expression level in liver tissue of mice in each group（±s，n＝4）

表2 各組小鼠肝組織中Keap1-Nrf2信號通路相關蛋白表達水平測定結果（±s，n＝4）Tab 2 Determination results of Keap1-Nrf2 signal pathway related protein expression level in liver tissue of mice in each group（±s，n＝4）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組陽性組SALD低劑量組SALD中劑量組SALD高劑量組GCLC/β-actin 0.460±0.047 0.234±0.038＊0.497±0.069#0.500±0.065#0.601±0.050##0.500±0.063#Nrf2/PCAN 0.509±0.101 0.363±0.037＊0.362±0.045 0.609±0.039##0.513±0.032#0.562±0.033#Keap1/PCAN 0.530±0.019 0.314±0.037＊0.379±0.029 0.740±0.021##0.707±0.034##0.530±0.030#HO-1/β-actin 0.412±0.059 0.155±0.038＊0.541±0.041#0.770±0.029#1.150±0.021##0.869±0.027#NQO1/β-actin 0.776±0.091 0.772±0.079 1.269±0.093#1.645±0.121##1.162±0.084#1.112±0.087#

4 討論

APAP是臨床應用廣泛的乙酰苯胺類解熱鎮痛藥物，是引發藥物性肝損傷的常見藥物[10]。20世紀初期APAP開始得到普遍應用，過量或者同時服用2～3種含有該成分的藥品易發生一系列不良反應，其中最不容忽視的就是其對肝的損傷，嚴重時會引發肝衰竭甚至危及生命[11-12]。因此，APAP誘發的肝毒性已成為研究藥物所致肝疾病的必要內容。

APAP的中毒主要表現為肝小葉中央型肝實質壞死和細胞網架的塌陷。臨床上，肝壞死表現在中毒后幾小時比較明顯，伴有AST、ALT、ALP和LDH的大幅度升高[12]，這些指標反應了肝組織壞死的程度。APAP中毒后可以采取催吐洗胃和導瀉等措施。此外，還可以服用活性炭，吸附腸道內APAP，減少其吸收。而臨床最常用的解毒劑是NAC，其可通過維持肝組織中谷胱甘肽濃度，阻止大分子硫醇基團被氧化進而發揮保護作用，故本研究以其為陽性對照藥。

SALD是紅景天中最主要的有效成分之一，通常將其含量作為評價紅景天藥用價值的重要指標[13]。SALD具有抗缺氧、清除自由基和抗氧化等作用[14]。本研究發現，SALD可以逆轉APAP引起的小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量的增加。組織病理結果提示，SALD還可以改善肝細胞壞死的情況，但SALD高劑量組效果不如中劑量組。有研究報道[15-16]，SALD對免疫系統具有激活作用。因此筆者推測，高劑量的SALD可能誘發了炎癥反應，進而抵消了其保護作用，但其具體原因還需進一步的研究進行驗證。

Nrf2是Keap1-Nrf2信號通路中的一個重要因子，其通過與細胞核內的抗氧化反應原件（ARE）結合，上調抗氧化酶的表達以抵抗自由基的氧化作用[17]。生理條件下，Nrf2被Keap1偶聯，隔離于細胞的細胞質中；外來刺激下，Nrf2被激活，從Nrf2-Keap1二聚體釋放轉移進入細胞核，繼而通過與ARE結合啟動下游基因的表達，發揮其抗氧化作用[18]。本研究結果顯示，APAP損傷小鼠肝組織中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1和GCLC蛋白表達水平均不同程度降低，而SALD可顯著升高上述蛋白的表達。而Nrf2入核后，可與ARE結合啟動下游HO-1、NQO1、GCLC基因的表達，發揮抗氧化作用。

綜上所述，SALD對APAP誘導肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能與促進Nrf2和Keap1入核，增強肝組織中HO-1、NQO1和GCLC蛋白的表達有關，但其確切作用機制還有待進一步研究。

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