丹皮酚對強直性脊柱炎模型小鼠Wnt和BMP/Smad信號轉導通路的影響Δ

吳琪，吳倩，周曉紅，吳玲慧（1.湖北中醫藥大學臨床技能實訓中心，武漢0061；.上海市東方醫院南院血液透析室，上海 001；.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，武漢 0061；.咸寧市婦幼保健院兒童保健中心計劃免疫科，湖北咸寧 7000）

強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是以骶髂關節和脊柱慢性炎癥為主的全身性疾病[1]，最終病變發展為中樞關節的纖維化和骨性強直[2]，并由此引起腰背僵硬或疼痛、脊柱強直、畸形愈合等臨床癥狀[3]。據統計，我國AS患病率為0.3%，且好發于青、中年男性[4]，具有較高的致殘率和至畸率，目前已成為國內外人口與健康研究領域的研究重點[5]。病理形成骨是AS患者致殘的主要原因，AS治療最終必須解決正常韌帶及滑膜骨化強直問題[6]。成骨過程受多種因素、多個信號路徑的調節，經典的分泌型糖蛋白（Wnt）和骨形態發生蛋白（BMP）信號通路在調節成骨細胞功能及骨形成中發揮重要的協同作用[7-8]。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNF-α）是觸發AS“炎癥因子風暴”級聯瀑效應的關鍵因子之一，其與AS韌帶骨化具有密切的聯系[9]。

丹皮酚（Paeonol）為蘿藦科植物徐長卿的主要藥理成分，具有與非甾體類抗炎藥相似的藥理作用，包括解熱鎮痛、抗炎、抗氧化、調節細胞免疫、誘導腫瘤細胞凋亡以及抗輻射等，且不良反應少，具有治療慢性炎癥風濕性疾病的潛力[10-12]。目前，關于丹皮酚抑制多種腫瘤作用的研究報道較多，而關于其對AS病理性骨化相關信號轉導通路的影響尚未見報道。故本研究以蛋白聚糖（PG）誘導的AS小鼠為模型，通過觀察骶髂關節滑膜細胞超微病理結構變化，檢測血清中炎癥相關細胞因子TNF-α和Wnt信號通路病理性骨化相關因子（DKK-1）的含量，研究丹皮酚對滑膜細胞BMP-2、Smad1及Cbfα1 mRNA表達的影響，探討其對Wnt和BMP/Smad病理性骨化相關信號轉導通路的調控作用，為丹皮酚臨床治療AS以及闡明其作用機制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

HT-770型透射電鏡（日本日立高新技術公司）；C2500-R-230V微型高速離心機（美國Labnet公司）；ICV-450型電熱恒溫培養箱（日本Asone科學儀器公司）；Multiskan MK3型全自動酶標儀（美國Thermo公司）；DHG 9203A型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Iiiumina生物科技公司）；Nano-100型微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

丹皮酚片（廣西億康藥業股份有限公司，批號：H45021119，規格：40 mg/片）；柳氮磺吡啶腸溶片（上海信誼天平藥業有限公司，批號：H31020557，規格：0.25 g/片）；PG（美國Sigma公司，批號：D-8428，純度：＞99%）；完全弗氏佐劑（美國MP Bio公司，批號：642857，純度：＞99%）；小鼠TNF-α酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：E-EL-M0049c）、小鼠DKK-1 ELISA試劑盒（批號：E-EL-M0024c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒（Trizol，北京艾德萊生物科技有限公司，批號：252250AX）；Hiscript逆轉錄酶（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號：R101-01/02）；Taq Plus DNA Polymerase聚合酶、DL2000 DNA Marker（北京天根生化科技有限公司，批號：ET105-01、D114-02）；PCR引物由北京擎科生物技術公司合成；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級BALB/c小鼠40只，♂，鼠齡（16±4）周，體質量（20±3）g，由武漢大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2008-0004。實驗過程中對動物的處置符合科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求。

2 方法

2.1 分組與造模

將小鼠適應性飼養1周后隨機分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶組和丹皮酚組，每組10只。除正常組外，其余3組小鼠均復制AS模型，具體操作如下：將完全弗氏佐劑100 μL、PG 100 μL混合，分別在第0、3、6周注入小鼠腹腔[13]。

2.2 給藥與取材

參照臨床用藥劑量，丹皮酚的小鼠給藥劑量為3 mg/kg（臨用前用蒸餾水溶解后配成0.3 mg/mL的溶液），柳氮磺吡啶的小鼠給藥劑量為9 mg/kg（臨用前用蒸餾水溶解后配成0.9 mg/mL的溶液），正常組和模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水。從造模成功后的第1天開始，各組小鼠分別灌胃相應藥物，每日1次，連續用藥20 d。末次給藥后，摘除小鼠眼球，通過眼底靜脈叢采血800～1 000 μL，以離心半徑為6 cm、3 000 r/min離心10 min，留取血清，－20℃冰箱保存；并于小鼠骶髂關節切取滑膜組織置于凍存管中，－80℃冰箱保存。

2.3 血清中TNF-α、DKK-1含量測定

采用ELISA法測定小鼠血清中TNF-α、DKK-1含量，具體操作按照相應試劑盒說明進行，通過酶標儀讀取吸光度（A）值，并計算其含量。

2.4 骶髂關節滑膜細胞超微結構觀察

取小鼠雙側骶髂關節面約2 mm厚的滑膜組織標本，4%戊二醛0.1 mol/L酸緩沖液前固定，1%鋨酸后固定，梯度酒精逐級脫水，環氧樹脂包埋劑EPON812逐級浸泡、包埋，定位后行超薄切片，透射電鏡觀察滑膜細胞內細胞器形態變化。

2.5 滑膜組織中BMP-2、Smad1和Cbfα1 mRNA表達測定

采用實時熒光定量PCR法測定小鼠滑膜組織中BMP-2、Smad1和Cbfα1 mRNA表達。取100 mg滑膜組織，勻漿后，按照Trizol法提取總RNA。取溶解后的總RNA 2 μL，用微量分光光度計測定樣本的濃度和純度。取總RNA按照逆轉錄反應體系逆轉錄成cDNA，反應條件為25℃、5 min；50 ℃、15 min，85 ℃、5 min，4 ℃、10 min。將cDNA作10倍稀釋后進行PCR擴增，引物序列：β-肌動蛋白（β-actin）上游序列為5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游序列為5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，擴增產物長度為 240 bp；BMP-2上游序列為5′-TGTGAGGATTAGCAGGTCTTTG-3′，下游序列為5′-TCTCGTTTGTGGAGCGGATG-3′，擴增產物長度為111 bp；Smad1上游序列為5′-GGCGACATATTGGGAAAGGA-3′，下 游 序 列 為 5′-TGAAAGCCGTGGTGGTAGTT-3′，擴增產物長度為121 bp；Cbfα1 上游序列為 5′-GGACGAGGCAAGAGTTTCA-3′，下 游 序 列 為 5′-TGGTGCAGAGTTCAGGGAG-3′，擴增產物長度為249 bp。擴增條件：95℃、10 min ；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，72 ℃、40 s，共循環40次。反應體系：cDNA（10倍稀釋）4 μL，上、下游引物（100 μmol/L）各0.4 μL，SYBR Green Master Mix預混液10 μL，50×ROX Reference Dye預混液0.2 μL，水5 μL。保存熒光定量PCR擴增BMP-2、Cbfα1、Smad1、β-actin基因的擴增曲線及解鏈曲線。以β-actin為內參，采用2－ΔΔct法計算各目的基因的相對表達量。

2.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計分析。數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清中TNF-α、DKK-1含量測定結果

與正常組比較，模型組小鼠血清中TNF-α含量明顯增加（P＜0.01），DKK-1含量明顯減少（P＜0.01）。與模型組比較，柳氮磺吡啶組和丹皮酚組小鼠血清中TNF-α含量均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），丹皮酚組小鼠血清中DKK-1含量明顯增加（P＜0.05），結果見表1。

表1 各組小鼠血清中TNF-α、DKK-1含量測定結果（±s，n＝10，ng/mL）Tab 1 Serum contents of TNF-α and DKK-1 of mice in each group（±s，n＝10，ng/mL）

表1 各組小鼠血清中TNF-α、DKK-1含量測定結果（±s，n＝10，ng/mL）Tab 1 Serum contents of TNF-α and DKK-1 of mice in each group（±s，n＝10，ng/mL）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組柳氮磺吡啶組丹皮酚組DKK-1 2 650.744±53.761 1 487.615±64.902＊＊1 862.794±25.958 2 174.349±20.327#劑量，mg/kg 9 3 TNF-α 92.463±2.146 251.142±6.213＊＊192.286±4.694#137.352±6.541##

3.2 骶髂關節滑膜細胞超微病理結構觀察結果

正常組：滑膜細胞疏松平行排列，滑膜層由細胞層和內膜下層構成，可見絨毛，內含膠原性纖維；滑膜細胞有A、B兩型，均無異常；巨噬細胞樣A型細胞的細胞質內含豐富的線粒體、囊泡和溶酶體；成纖維細胞樣B型細胞含有高濃度的內質網，少量線粒體和空泡。模型組：滑膜細胞排列紊亂，細胞內膜明顯增厚，細胞質內細胞器變形，胞核內染色質分布不均。柳氮磺吡啶組：滑膜層細胞性內膜增生，B型細胞的細胞質內線粒體腫脹，粗面內質網擴張，有大量空泡形成，胞核凹陷。丹皮酚組：滑膜細胞層輕度增厚，排列均勻，A型細胞的細胞質內線粒體輕度腫脹，初級溶酶體多見；B型細胞的細胞質內粗面內質網豐富，胞核內染色質分布均勻。各組小鼠骶髂關節滑膜細胞超微結構觀察結果見圖1。

3.3 滑膜組織中BMP-2、Smad1和Cbfα1 mRNA表達測定結果

與正常組比較，模型組小鼠滑膜組織中BMP-2、Cbfα1、Smad1 mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，丹皮酚組小鼠滑膜組織中BMP-2、Cbfα1和Smad1 mRNA表達水平均不同程度降低（P＜0.05），而柳氮磺吡啶組小鼠滑膜組織中BMP-2、Cbfα1、Smad1 mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），結果見表2。

圖1 各組小鼠骶髂關節滑膜細胞超微結構觀察的透射電鏡圖（×5 000）Fig 1 Transmission electron microscopy of ultramicrostructure of synovial cells of mice in each group（×5 000）

表2 各組小鼠滑膜細胞中BMP-2、Cbfα1和Smad1 mRNA表達測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of BMP-2，Cbfα1 and Smad1 mRNA in synovial cells of mice in each group（±s，n＝10）

表2 各組小鼠滑膜細胞中BMP-2、Cbfα1和Smad1 mRNA表達測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of BMP-2，Cbfα1 and Smad1 mRNA in synovial cells of mice in each group（±s，n＝10）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05

組別正常組模型組柳氮磺胺吡啶組丹皮酚組2－ΔΔct值Smad1 mRNA 1 1.762±0.163＊＊1.597±0.214 1.224±0.115#BMP-2 mRNA 1 3.141±0.295＊＊2.596±0.331 1.628±0.207#Cbfα1 mRNA 1 2.342±0.283＊＊1.961±0.305 1.428±0.146#

4 討論

滑膜組織內A、B型滑膜細胞是AS骨破壞和病理性骨化的效應細胞。本研究結果顯示，模型組小鼠滑膜細胞增生，排列紊亂，細胞間隙增寬；丹皮酚組小鼠滑膜細胞細胞質中線粒體、溶酶體、粗面內質網的形態明顯改善，表明丹皮酚可減輕滑膜細胞變性和損傷。

AS炎癥反應與新骨形成都是由眾多細胞因子和信號通路組成的錯綜復雜的調控機制網絡。在骨形成的早期階段主要由BMP信號轉導通路調控，在成骨晚期階段主要由Wnt信號轉導通路為成骨細胞的發生和新骨形成傳遞信號，是骨重塑的重要調控者[14]。其中DKK-1是Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路最主要的抑制因子。研究證實，在AS患者中DKK-1出現功能失調而出現Wnt信號通路活化，導致新骨形成[15]。炎癥與新骨形成之間有一定關聯，而TNF-α是炎癥細胞因子網絡的關鍵因子[15]。BMP是多功能生長因子，除BMP-1外均屬于轉化生長因子β（TGF-β）超家族，BMP能通過Smad途徑上調成骨轉錄因子Osx的表達而介導成骨基因轉錄發揮作用[16]。因此，TNF-α、Wnt信號通路以及BMP信號通路之間平衡的變化決定著新骨的形成。傳統的一線抗風濕藥物（如柳氮磺吡啶）在延緩AS進行性結構破壞的療效上并不確切。本研究通過ELISA檢測發現，與模型組比較，丹皮酚在降低血清中TNF-α含量和增加血清中DKK-1含量方面優于柳氮磺吡啶。這說明丹皮酚可以通過降低血清中TNF-α含量，增加血清中DKK-1含量，從而抑制Wnt信號通路傳導和延緩病理性骨形成。通過實時熒光定量PCR結果顯示，丹皮酚可明顯下調模型小鼠滑膜組織中BMP-2、Cbfα1和Smad1 mRNA表達，從而阻斷成骨細胞通路靶基因表達，這與電鏡顯示丹皮酚干預后滑膜細胞超微結構形態改善相符。

綜上所述，丹皮酚可通過協同抑制Wnt和BMP/Smad骨化相關信號轉導通路逆轉滑膜細胞成骨分化，從而發揮其對AS的防治作用。下一步筆者將深入探討丹皮酚不同濃度和不同給藥時間對早期AS模型病理性骨化的影響。

[1]NEERINCKX B，LORIES R.Mechanisms impact and prevention of pathological bone regeneration in spondyloarthritis[J].Curr Opin Rheumatol，2017，29（4）：287-292.

[2]MOLTO A，GRANGER B，WENDLING D，et al.Use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in early axial spondyloarthritis in daily practice：data from the DESIR cohort[J].Joint Bone Spine，2017，84（1）：79-82.

[3]LORIES RJ，HAROON N.Bone formation in axial spondyloarthritis[J].Best Pract Res Clin Rheumatol，2014，28（5）：765-777.

[4]YANG Y，DAI M.Expression of PADI4 in patients with ankylosing spondylitis and its role in mediating the effects of TNF-α on the proliferation and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].Int J Mol Med，2015，36（2）：565-570.

[5]BLEIL J，SIEPER J，MAIER R，et al.Cartilage in facet joints of patients with ankylosing spondylitis（AS）shows signs of cartilage degeneration rather than chondrocyte hypertrophy：implications for joint remodeling in AS[J].Arthritis Res Ther，2015.DOI：10.1186/s13075-015-0675-5.

[6]RANGANATHAN V，GRACEY E，BROWN MA，et al.Pathogenesis of ankylosing spondylitis-recent advances and future directions[J].Nat Rev Rheumatol，2017，13（6）：359-367.

[7]BROWN MA，KENNA T，WORDSWORTH BP.Genetics of ankylosing spondylitis-insights into pathogenesis[J].Nat Rev Rheumatol，2016，12（2）：81-91.

[8]ASHE HL.Modulation of BMP signalling by integrins[J].Biochem Soc T，2016，44（5）：1465-1473.

[9]ALTONEN K，HEINONEN A，JOENSUU J，et al.Effectiveness and drug survival of TNF-inhibitors in the treatment of psoriatic arthritis：a prospective cohort study[J].Semin Arthritis Rheu，2017，46（6）：732-739.

[10]耿帥，趙育林，曾凱，等.丹皮酚的研究進展[J].中國新藥與臨床雜志，2016，38（5）：310-313.

[11]TSAI CY，KAPOOR M，HUANG YP，et al.Synthesis and evaluation of aminothiazole-paeonol derivatives as potential anticancer agents[J].Molecules，2016，21（2）：145-154.

[12]吳琪，周曉紅，楊德才，等.徐長卿-二妙散-三藤方對蛋白聚糖誘導關節炎模型小鼠血清中TNF-α和DKK-1含量的影響[J].中國藥房，2017，28（31）：4369-4372.

[13]童文文，李甲，徐衛東.蛋白聚糖誘導小鼠關節炎模型的研究進展[J].第二軍醫大學學報，2015，36（5）：530-535.

[14]HE GX，ShI Y，LIM J，et al.Differential involvement of Wnt signaling in Bmp regulation of cancellous versus periosteal bone growth[J].Bone Res，2017.DOI：10.1038/boneres.

[15]DEES C，SCHLOTTMANN I，FUNKE R，et al.The Wnt antagonists DKK1 and SFRP1 are downregulated by promoter hypermethylation in systemic sclerosis[J].Ann Rheum Dis，2014，73（6）：1232-1239.

[16]DONG M，YU DS，DURAIPANDIYAN V，et al.The protective effect of chrysanthemum indicum extract against ankylosing spondylitis in mouse models[J].Biomed Res Int，2007.DOI：10.1155/2017/8206281.