HPLC-QAMS同時測定復方黃芩片中6種活性成分的含量

胡 丹（宿州市食品藥品檢驗檢測中心，安徽宿州 234000）

復方黃芩片由黃芩、虎杖、穿心蓮和十大功勞4味中藥材組成，具有清熱解毒、涼血消腫之功效，用于咽喉腫痛、口舌生瘡、感冒發熱、癰腫瘡瘍[1]。黃芩中含有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等黃酮類成分，有清熱燥濕、瀉火解毒的功效；虎杖中含有虎杖苷，有抗菌消炎、利濕退黃、清熱解毒、止咳化痰的功效；穿心蓮中含有穿心蓮內酯及脫水穿心蓮內酯，具有清熱解毒、涼血消腫的功效[2]。已有針對虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯含量測定的文獻報道[2-8]，但是涉及到多種成分同時測定時需要對照品數量多，但某些對照品提純難度大，使用成本較高。一測多評法（QAMS）的廣泛應用，實現了以樣品中某一廉價易得的對照品為內參對多種有效成分質量的同步控制的要求，該方法在中成藥及中藥飲片質量控制中得到了較廣泛的應用[9-13]，但采用QAMS法測定復方黃芩片的有效成分的含量尚未見報道。本研究建立了高效液相色譜（HPLC）-QAMS法同時測定復方黃芩片中6種活性成分的含量，以黃芩苷為內標，計算虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯與其之間的相對校正因子（RCF），利用RCF測定各組分含量，并將結果與外標法（ESM）測得數據進行比較分析。

1 材料

1.1 儀器

e2695 Waters HPLC儀，包括2695 Alliance四元梯度泵、2695 Alliance自動進樣器、Empower3色譜工作站、2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；1260 Infinity HPLC儀，包括G1311C四元梯度泵、G1329B自動進樣器、Agilent EZchrom色譜工作站、G4212B二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；3000 Ultimate HPLC儀，包括HPG-3x00A二元泵、Split-Loop自動進樣器、Chromeleon 7色譜工作站、PDA-3000二極管陣列檢測器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Quintix 224萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；D115烘箱（德國Binder公司）；SP3-100AL超聲波清洗機（上海泗裴電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復方黃芩片（肇慶星湖制藥有限公司，批號：1702062、1703078、1708045、1708067、1709023，規格：每片0.33 g）；黃芩苷對照品（批號：110715-201619，純度：93.5%）、虎杖苷對照品（批號：111575-201603，純度：87.3%）、漢黃芩苷對照品（批號：112002-201501，純度：98.8%）、黃芩素對照品（批號：111595-201306，純度：97.8%）、穿心蓮內酯對照品（批號：110797-201108，純度：98.7%）、脫水穿心蓮內酯對照品（批號：110854-201508，純度：99.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 QAMS法概念與原理

QAMS法是通過中藥有效成分間存在的內在函數關系和比例關系，通過測定中藥中某個代表性成分（易得、廉價、有效）的含量，依據RCF計算出該中藥中其他多種待測成分（對照品難以得到或難供應）的含量，使其計算值與實測值符合定量方法學要求的一種多指標質量同步控制方法[14]。在一定線性范圍內某成分的量（質量或濃度）與檢測器響應值成正比，即f＝A/C（f為校正因子，A表示響應值，C表示濃度）。QAMS是以藥材中某一典型組分s（一般該組分對照品易得、廉價）為內參物，建立內參物s與其他待測組分k之間的RCF（fk/s），即fk/s＝fk/fs＝（Ak×Cs）/（Ck×As），再通過校正因子計算其他組分的含量Ck＝（Cs×Ak）/（As×fk/s）[15]。

2.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，5%→15%A；12～25 min，15%→30%A；25～40 min，30%→45%A；40～50 min，45%→55%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：306 nm（0～7 min虎杖苷）、275 nm（7～15 min黃芩苷）、225 nm（15～23 min穿心蓮內酯）、275 nm（23～37 min漢黃芩苷、黃芩素）、254 nm（37～50 min脫水穿心蓮內酯）；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液 精密稱取虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯對照品各適量，置于同一100 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 mL含虎杖苷182.2 μg、黃芩苷1 881.2 μg、漢黃芩苷509.2 μg、黃芩素 515.2 μg、穿心蓮內酯 105.3 μg、脫水穿心蓮內酯140.3 μg的混合對照品溶液，室溫避光保存，備用。

2.3.2 供試品溶液 取復方黃芩片20片，去除糖衣，研細，得復方黃芩片細粉。取復方黃芩片細粉約1 g，精密稱定，置于50 mL棕色量瓶中，加入30 mL 50%甲醇溶液，室溫超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min后取出，放冷，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得，室溫避光保存。

2.3.3 陰性樣品溶液 按照復方黃芩片處方工藝分別制備不含虎杖、黃芩和穿心蓮的陰性樣品，按供試品溶液制備和測定方法進行處理，即得。

2.3.4 空白溶劑 取適量甲醇作為空白溶劑。

2.4 系統適用性及專屬性試驗

在“2.2”項色譜條件下，精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL進樣，結果各組分與前后峰分離度均大于1.8，對稱因子在1.12～1.45之間，理論板數以虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯峰計均＞5 000。陰性樣品溶液色譜圖中在與樣品中虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯保留時間相應位置上未見色譜峰，說明其他藥味對測定無干擾。色譜圖見圖1。

2.5 線性關系考察

分別精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于同一20 mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，繪制各組分標準曲線，計算回歸方程和相關系數。結果表明，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯在試驗范圍內成良好的線性關系，見表1。

2.6 檢測限與定量限考察

表1 線性關系考察結果（n＝6）Tab 1Results of linear range investigation（n＝6）

取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積，當信噪比為3∶1時即為檢測限；當信噪比為10∶1時即為定量限。結果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯檢測限分別為2.25、6.92、1.76、4.69、1.37、1.51 ng，定量限分別為 6.89、19.98、5.28、13.81、4.15、4.71 ng。

2.7 精密度試驗

精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯及脫水穿心蓮內酯峰面積的RSD分別為0.53%、1.02%、1.18%、0.85%、0.76%、0.66%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗

取同一供試品溶液（批號：1702062），分別于制備后0、3、6、9、12、24、48 h按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯及脫水穿心蓮內酯峰面積的RSD分別為0.35%、0.56%、0.52%、0.62%、0.92%、0.43%、0.89%（n＝7），表明供試品溶液48 h內穩定性良好。

2.9 重復性試驗

取同一批供試品（批號：1702062），按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算6種成分的含量及其RSD值。結果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯及脫水穿心蓮內酯的平均含量分別為2.14、22.56、5.85、6.05、1.36、1.65 mg/g，RSD分別為0.59%、0.41%、0.89%、1.02%、0.85%、1.12%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量的復方黃芩片（批號：1702062）細粉，共9份，每份約0.5 g，分成3組，精密稱定后分別置于50 mL棕色量瓶中，分別加入“2.3.1”項下混合對照品溶液4、6、8 mL，按“2.3.2”項下供試品溶液方法制備，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算各成分加樣回收率及其RSD值。結果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯及脫水穿心蓮內酯的平均加樣回收率分別為98.2%、98.8%、97.9%、98.9%、98.8%、98.7%，RSD分別為1.32%、1.14%、1.23%、1.00%、0.91%、1.12%（n＝9）。

2.11 RCF的計算

在標準曲線y＝ax+b中，x＝（y－b）/a＝y/a－b/a，由于b值通常為誤差引起，在a/b值大于100時，b/a值可以忽略不計，此時可以公式x＝y/a直接計算其含量。故RCF可以二者的斜率a的比直接計算，計算公式為fk/s＝ak/as，式中as為內參物標準曲線斜率；ak為其他待測組分標準曲線斜率。根據表1中回歸方程，以275 nm波長下黃芩苷為內參物（1.000），306 nm波長下的虎杖苷RCF為0.529；275 nm波長下的漢黃芩苷、黃芩素的RCF分別為0.506、1.004；225 nm波長下的穿心蓮內酯RCF為0.831；254 nm波長下的脫水穿心蓮內酯RCF為1.087。

2.12 RCF重現性考察

考察流動相各梯度點組分比例變化、流速變化、柱溫變化以及各成分檢測波長變化時對RCF的影響。結果，流動相各梯度點比例變化±5%，流速變化±10%，柱溫變化±5℃，各活性成分檢測波長變化±2 nm時對各成分的RCF影響較小，RSD均在3.0%以內。另外，本研究還考察了不同品牌HPLC儀及3種不同品牌色譜柱ZORBAX Eclipse XDB C18、Inertsil ODS-SPHPLC Column、Waters Sunfire C18（規格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）對RCF的影響，結果不同HPLC儀、不同色譜柱條件下虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯RCF的RSD依次為1.3%、1.4%、1.0%、0.9%、1.4%，RSD均小于2.0%。不同HPLC儀器及色譜柱對RCF的影響見表2。

表2 不同HPLC儀器及色譜柱對RCF的影響（n＝3）Tab 2 Effects of different HPLC instrument and chromatographic column on RCF（n＝3）

2.13 待測色譜峰的定位

色譜峰的準確定位是QASM法應用的關鍵，可采用保留時間差（指各待測成分與內參物間保留時間的差值）或相對保留時間（指各待測成分與內參物間保留時間的比值）等參數，并結合色譜圖整體特征，以及每個峰的紫外吸收特征來定位待測成分色譜峰[15]。本研究通過考察保留時間差和相對保留時間兩種參數在不同品牌HPLC儀和不同品牌色譜柱中的重現性。結果，保留時間差的波動較為明顯（RSD＞5%），相對保留時間的波動相對較小（RSD＜3.5%）。因此，采用相對保留時間法進行待測成分色譜峰的定位。但是對于成分復雜的樣品，可選用定性用的對照品或“對照提取物”對待測成分進行定位，此法峰定位準確，受色譜條件及內參物變化干擾小[16]。

2.14QASM與ESM結果比較

按“2.2”項下色譜條件，分別精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進樣測定，記錄虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的峰面積，分別采用ESM和QASM對5批復方黃芩片中6種活性成分含量進行測定，并利用統計軟件SPSS 22.0對兩組含量結果進行成組t檢驗，驗證QASM方法的準確性。結果，兩種方法測得6種活性成分含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 不同方法測定復方黃芩片中6種成分含量的結果（n＝3，mg/g）Tab 3 Determination results of 6 components in Compound huangqin tablets by different methods（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動相的選擇 在選擇流動相時，筆者分別考察了甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液及乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液。結果，甲醇-0.05%磷酸作為流動相時，穿心蓮內酯及脫水穿心蓮內酯未被檢出；而采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液時，黃芩苷和虎杖苷色譜峰分離度未達到要求；當采用乙腈-0.05%磷酸溶液流動相系統時，6種活性成分色譜峰與相鄰雜質峰分離完全，對稱因子在1.12～1.45之間，故以此作為流動相。

3.1.2 檢測波長的選擇 在選擇檢測波長時，筆者在190～400 nm波長段分別掃描6種活性成分混合對照品溶液，結果虎杖苷在306 nm波長處有最大吸收，黃芩苷在278 nm波長處有最大吸收，漢黃芩苷在275 nm波長處有最大吸收，黃芩素在274 nm波長處有最大吸收，穿心蓮內酯在225 nm波長處有最大吸收，脫水穿心蓮內酯在254 nm波長處有最大吸收。參考文獻[2-8]，最終確定虎杖苷檢測波長為306 nm，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素檢測波長為275 nm，穿心蓮內酯檢測波長為225 nm，脫水穿心蓮內酯檢測波長為254 nm。本試驗采用波長切換法，在不同時段改變檢測波長，保證了6種活性成分均在最佳吸收波長處檢測。

3.2 檢測方法的選擇

文獻[2-3]在測定復方黃芩片中有效成分含量時，采用獨立對照品用ESM測定其含量，經方法學驗證，均得到可靠結果。另HPLC定量方法中一般以回歸方程法計算結果最為準確，但當標準曲線a/b值大于100時，可采用外標法一點法計算，ESM也是應用最為普遍的定量方法[17]。故本研究選擇ESM測得數據結果進行比對來驗證QASM的準確性。黃芩苷為黃芩藥材中的主要成分之一，也是黃芩的特征性成分代表，化學性質穩定，容易取得，故選其作為內參物，對虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯進行定量。

4 結論

本研究建立的QASM法可同時測定復方黃芩片中6種活性成分含量，以黃芩苷為內參物，分別計算虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯與內參物之間的RCF，并通過不同儀器、不同色譜柱、改變柱溫、改變檢測波長及調整流動相比例等因素考察QASM法的耐用性，結果改變上述條件對各成分RCF影響均很小。通過比較ESM法和QASM法對5批復方黃芩片含量測定的結果，得出兩種方法測定結果差異無統計學意義（P＞0.05），驗證了QASM法用于復方黃芩片中6種活性成分質量評價的準確性。

綜上，本研究建立的方法簡單、有效、結果準確、節約成本，可用于復方黃芩片中上述6種活性成分含量的同時測定。

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