苗藥婦膚康噴霧劑的HPLC指紋圖譜研究Δ

廖秀，許晶晶，楊艷，李立郎，王科，李齊激#，楊小生（.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴陽 55004；2.遵義醫學院藥學院，貴州遵義 56000；.貴州良濟藥業有限公司，貴州龍里55206）

婦膚康噴霧劑由爵床和千里光兩味藥材組成，為貴州省婦科用苗藥獨家品種，具有清熱解毒、活血止痛、殺蟲止癢的功效，主要用于霉菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎、細菌性陰道炎、外陰炎、皮膚瘙癢等婦科疾病的治療[1-4]。爵床作為君藥，是爵床科植物爵床的干燥全草，其主要成分為爵床定A、爵床定B、Cleistanthin-B、6′-羥基-爵床定B等為代表的木脂素類成分，在抗腫瘤、抗菌、抗炎、誘導細胞調亡等方面表現出較好的生物活性[5-11]，與該制劑“清熱解毒，活血止痛”的功效基本吻合。目前，該制劑及其君藥爵床現存標準僅以性狀與薄層色譜鑒別進行質量控制，無法全面地反映該制劑質量。筆者在前期工作研究基礎上[12]，擬選6′-羥基-爵床定B和爵床定B為測定指標，對10批婦膚康噴霧劑進行研究，建立了婦膚康噴霧劑高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并測定了其中6′-羥基-爵床定B和爵床定B含量，以期為全面控制和評價該制劑提供參考。

1 材料

1.1 儀器

U3000 HPLC儀，包括二元梯度泵、紫外檢測器色譜工作站（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BS-210S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；AG285電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

婦膚康噴霧劑[貴州良濟藥業有限公司，批號：20150601～201506010（編號：S1～S10），規格 ：100 mL/瓶]；6′-羥基-爵床定B對照品（批號：2015011901，純度：＞98%）、爵床定B對照品（批號：2015011902，純度：＞98%）均由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室自制，經HPLC、質譜、核磁共振進行結構鑒定和純度檢測；乙腈、甲醇為色譜純，無水乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～15 min，4%A；15～20 min，4%→15%A；20～25 min，15%→20%A；25～30 min，20%→25%A；30～40 min，25%→35%A；40～50 min，35%→60%A；50～55 min，60%→80%A；55～65 min，80%→90%A）；流速：0.6 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：262 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱量6′-羥基-爵床定B、爵床定B對照品適量，加甲醇溶解，制成質量濃度均為1mg/mL的單一對照品溶液。取6′-羥基-爵床定B單一對照品溶液4 mL、爵床定B單一對照品溶液2 mL，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇稀釋，定容，得每1 mL分別含6′-羥基-爵床定B 40 μg、爵床定B 20 μg的混合對照品溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 供試品溶液 吸取婦膚康噴霧劑樣品適量，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 空白對照溶液 將等量的甲醇和70%乙醇溶劑混合均勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，在該色譜條件下，6′-羥基-爵床定B和爵床定B與各雜質峰間均能達到基線分離，分離度＞1.5，理論板數按6′-羥基-爵床定B計＞3 000?？瞻讓φ盏幕€平穩，表明溶劑及流動相對爵床藥材的HPLC特征圖譜檢測基本無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10、12 mL，精密配制成每1 mL分別含6′-羥基-爵床定B 8、16、24、32、40、48 μg/mL和爵床定B 4、8、12、16、20、24 μg/mL的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。線性關系考察結果見表1。

表1 線性關系考察結果（n＝6）Tab 1Results of linear relationship investigation（n＝6）

2.3.3 精密度試驗 取樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以6′-羥基-爵床定B的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜2.0%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取樣品（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以6′-羥基-爵床定B的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜2.0%（n＝7），表明供試品溶液室溫下放置24 h穩定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以6′-羥基-爵床定B的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜2.0%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取樣品（編號：S1）適量，共6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入6′-羥基-爵床定B 1.250 0 mg、爵床定B 0.500 0 mg，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests（n＝6）

表2結果顯示，6′-羥基-爵床定B和爵床定B平均加樣回收率分別為98.88%、98.65%，RSD分別為0.83%、0.95%，其結果在95%～105%之間，表明加樣回收率良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰的相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成及共有峰相關分析 分別取編號為S1～S10樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，得到10批次噴霧劑樣品的HPLC色譜圖。將10批樣品指紋圖譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版），以S1號樣品圖譜為校正圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，生成10批樣品指紋圖譜疊加模式（圖2）及對照指紋圖譜（圖3），確定10批樣品的共有峰為12個。根據保留時間指認圖譜中10號峰為6′-羥基-爵床定B，12號峰為爵床定B。以10號峰為參照峰，計算其他特征峰相對于10號峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表3、表4。

圖2 10批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 2 HPLC superposed fingerprints of 10 batches of samples

圖3 婦膚康噴霧劑樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 3 HPLC control fingerprints of Fufukang spray

表3 10批樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間Tab 3 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples

2.4.2 相似度分析 將共有峰模式的對照指紋圖譜及10批噴霧劑樣品圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版），采用相關系數法對樣品的相似度進行評價。結果，S1～S10相似度分別為0.947、0.987、0.989、0.988、0.909、0.913、0.925、0.901、0.927、0.929，均＞0.90，說明10批樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性[13]。

表4 10批樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積Tab 4 Relative peak areas of common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples

2.5 6′-羥基-爵床定B、爵床定B的含量測定

分別取S1～S10樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，10批樣品中 6′-羥基-爵床定 B 含量依次為 3.34、3.54、3.64、2.92、2.93、2.95、2.44、1.64、4.02、5.84 mg/100 mL；爵床定B 含量依次為 1.46、1.63、1.96、1.39、1.50、1.50、1.34、0.83、1.62、2.78 mg/100 mL。

3 討論

筆者前期試驗通過對檢測波長、流動相、流速、柱溫等色譜條件進行優化，對婦膚康噴霧劑樣品進行紫外（200～400 nm）全波長掃描，在262 nm波長處出峰較多，且檢測成分6′-羥基-爵床定B和爵床定B在此波長下吸光值最大，故選262 nm為檢測波長。隨后分別對乙腈-水、甲醇-水、不同濃度的冰醋酸/甲酸-乙腈等流動相進行了前期的預試驗，結果顯示在相同的條件下，乙腈-水作為流動相分離效果好，但基線不平穩；乙腈-0.2%冰醋酸為流動相，分離效果更好，基線更平穩，峰形更好，最終確定乙腈-0.2%冰醋酸為流動相，在此條件下又分別對流速、柱溫等色譜條件進行考察，最終確定色譜條件為262 nm為檢測波長、體積流量0.6 mL/min、柱溫25℃、乙腈-0.2%冰醋酸為流動相進行梯度洗脫。

通過對10批樣品指紋圖譜分析，得到不同樣品之間的相似度均在0.90以上，并標定了12個共有峰，各個色譜峰的保留時間匹配較好，說明不同批次樣品中的化學成分類型一致[14-15]。通過測定樣品中6′-羥基-爵床定B和爵床定B的含量發現，10批樣品中6′-羥基-爵床定B含量為1.64～5.84 mg/100 mL，爵床定B含量為0.83～2.78 mg/100 mL，不同批號間兩種檢測指標的含量存在較大差異，這可能是由于生產原料不穩定引起的。前期研究發現，不同產地爵床藥材中成分差異較大，且6′-羥基-爵床定B和爵床定B含量具有較大差異[12]，建議生產該制劑時，盡量選擇同一產地的藥材。但是也有可能是由于生產前對樣品提取不當或生產線上其他原因引起的，需進一步驗證。

綜上，本研究所建立的方法操作簡便，結果準確可靠，可為婦膚康噴霧劑的質量評價提供參考。

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