HPLC法同時測定蒙藥達烏里芯芭中梓醇和益母草苷的含量Δ

包玉秋，那仁朝克圖（1.內蒙古民族大學附屬醫院臨床蒙藥劑部，內蒙古通遼028000；2.內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古通遼 028000）

達烏里芯芭，蒙名為阿拉藤-艾給，俗名大黃花，為玄參科植物達烏里芯芭（Cymbaria dahuricaL.）的干燥全草。夏季花開時采收，曬干。味微苦，性涼。作為傳統蒙藥之一，達烏里芯芭具有燥協日烏素、清熱、止痛、止血、止癢消腫等功效，用于心、肺、腎等臟器急熱，疫熱，關節協日烏素病，協日烏素瘡，關節疼痛，外傷，膿瘍，膿腫，傷口滲血等[1]。達烏里芯芭記載于《認藥白晶鑒》和《無誤蒙藥鑒》中。1998年版《中華人民共和國衛生部藥品標準》（蒙藥分冊）收載了達烏里芯芭，但是到目前為止還未建立該藥材的檢查、薄層鑒別和含量測定等項[2]。蒙藥材達烏里芯芭中具有生物活性的化學成分為黃酮類、環烯醚萜苷類、甾醇類、肉桂酸衍生物等[3-7]，其主要成分為環烯醚萜苷類，梓醇和益母草苷即屬于環烯醚萜苷類成分。筆者已從達烏里芯芭全草的乙醇提取物中分離出含量較高的梓醇和益母草苷這2種成分，并且這2種成分具有抗炎、保護心臟等生物活性，這一活性與達烏里芯芭的功效燥協日烏素和治療心、肺、腎等臟器急熱作用基本吻合。因此，筆者在本研究中建立同時測定達烏里芯芭中梓醇和益母草苷含量的方法[8]，為達烏里芯芭的質量標準提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀，包括G1312C輸液泵、G1315D二極管陳列檢測器、G1329B進樣器、G1316A柱溫箱（美國Agilent公司）；MS105電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；N1100旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（德國Merck-Millipore公司）；DL450A超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）。

1.2 藥材

7批達烏里芯芭于2017年5月30日采集自內蒙古通遼市科左后旗阿古拉草原（批號分別為DWLXB-001～DWLXB-007），由內蒙古民族大學蒙醫藥學院蒙藥學教研室布和巴特爾教授鑒定為玄參科植物達烏里芯芭Cymbaria dahuricaL.的干燥全草，使用時取達烏里芯芭干燥全草粉碎后過4號篩。

1.3 對照品與試劑

對照品梓醇和益母草苷均由課題組那仁朝克圖等對達烏里芯芭前期化學成分分離精制得到[4]，批號分別是XB-ZC-001和XB-YMCG-001，經峰面積歸一化法確定純度均≥98%。乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：XSelect HSS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），采用梯度洗脫（0～10 min，93%→85%B；10～20 min，85%→76%B；20～35 min，76%→55%B；35～40 min，55%→93%B）；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取梓醇對照品4.25 mg、益母草苷對照品6.25 mg，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.17 mg的梓醇對照品溶液和每1 mL含0.25 mg的益母草苷混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取達烏里芯芭粉末1.0 g，置于圓底燒瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，稱定質量，回流提取1.0 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，過濾（0.45 μm），取續濾液，即得。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下供試品溶液、混合對照品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，在該色譜條件下，待測成分間、待測成分與雜質峰間均能達到基線分離，分離度大于1.5，其他成分對待測成分的測定無影響，梓醇和益母草苷的理論板數均不低于3 000，結果見圖1。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按5、10、15、20、25、30 μL等6個不同體積進樣，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以待測成分進樣量為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得梓醇、益母草苷的回歸方程分別為y＝79 537x+13 918（r＝0.999 6）、y＝83 737x+19 108（r＝0.999 5）。結果表明，梓醇、益母草苷進樣量分別在0.17～3.4、0.25～5.0 μg范圍內與各自的峰面積線性關系良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 檢測限與定量限考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3∶1時，測得檢測限；當信噪比為10∶1時，測得定量限。結果，梓醇、益母草苷的檢測限分別為3.57、4.72 ng，定量限分別為12.24、41.98 ng。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，每次10 μL，測定峰面積。結果，梓醇、益母草苷峰面積的RSD分別為1.54%、1.28%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批（批號：DWLXB-007）達烏里芯芭供試品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。結果，梓醇、益母草苷峰面積RSD分別為1.32%、1.60%（n＝6），表明該方法的重復性較好。

2.8 穩定性試驗

精密稱取同一批（批號：DWLXB-007）達烏里芯芭供試品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件以0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積。結果，梓醇、益母草苷峰面積RSD分別為1.28%、1.41%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：DWLXB-007）適量，共6份，每份約0.5 g，精密加入梓醇和益母草苷混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算平均加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

由表1結果顯示，梓醇加樣回收率為93.0%～97.3%，RSD為1.9%（n＝6），益母草苷回收率為92.1%～97.9%，RSD為2.4%（n＝6），表明本試驗所采用的測定方法結果準確、可靠，可用于樣品測定。

2.10 樣品含量測定

取7批達烏里芯芭藥材粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算各成分的含量。結果顯示，7批樣品中梓醇、益母草苷含量分別為0.53～0.81、0.79～1.25 mg/g，結果見表2。

表2 7批樣品的含量測定結果（mg/g，n＝3）Tab 2 Result of content determination of 7 batches of samples（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 提取方法與流動相的考察

在前期試驗中，筆者在提取方法的選擇時分別考察了氯仿超聲提取、氯仿∶甲醇（1∶1，V/V）超聲提取、50%甲醇回流提取、70%甲醇回流提取和甲醇回流提取等方法，結果表明采用甲醇回流提取時各指標成分提取率較高。筆者在流動相選擇時分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸水和乙腈-0.4%磷酸水，結果選用乙腈-0.4%磷酸水作為流動相進行梯度洗脫時分離度較高。

3.2 對照品及檢測波長的選擇

目前梓醇已被2015年版《中國藥典》（一部）[9]作為地黃的標準品，筆者查閱相關文獻得知梓醇和益母草苷具有抗炎、降糖、抗腫瘤和保護心臟等作用[10-13]，與達烏里芯芭的功效燥協日烏素和治療心、肺、腎等臟器急熱作用基本吻合。在波長的選擇時，采用二極管陣列檢測器對供試品及梓醇、益母草苷對照品進行200～800 nm全波長掃描得知最大吸收波長為203 nm處，因此選擇203 nm為檢測波長。

3.3 加樣回收試驗的討論

加樣回收率已達到2015年版《中國藥典》（四部）規定的待測成分含量0.1%，回收率限度90%～108%的定量要求[14]，RSD為2.4%，因天然藥物的成分具有復雜性和多樣性，其成分的含量為0.01%～0.1%時RSD的限度范圍可放寬。

3.4 含量測定方法的選擇

蒙藥材達烏里芯芭的質量控制方法目前只有顯微鑒別和薄層鑒別，還未建立含量測定項，因此為了有效地控制達烏里芯芭的質量，有必要建立含量測定方法，提高其質量標準。從近幾年的文獻報道中筆者發現，以梓醇為對照品測定芯芭的含量[15]文獻有1篇，芯芭藥材來源有蒙古芯芭和達烏里芯芭，從國內外的相關研究趨勢可看出天然藥物的質量控制方法[16-17]向儀器化和成分的代表性及多樣化方向發展。因此，選擇具有代表性和專屬性的指標成分進行質量控制的意義重大。

綜上，本研究所建立的方法快速簡便、穩定可靠，可用于達烏里芯芭中梓醇和益母草苷含量的同時測定。

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