癌蛋白LRP 6調節FGF 8信號對肺癌細胞增殖的影響研究

范文強，姬宇宙，劉先本

1焦作市第二人民醫院心胸外科，河南 焦作454001

2河南省腫瘤醫院胸部腫瘤一區，鄭州450008

肺癌是惡性腫瘤相關死亡的主要危險因素，是全球主要的公共衛生負擔之一，僅在中國，每年肺癌相關的發病和病死患者分別約為70萬例和60萬例[1-2]。目前，大多數肺癌患者就診時已處于晚期階段，5年生存率僅為15%，而早期肺癌患者的5年生存率為30%～40%，因此，早期診斷和有效治療可明顯延長肺癌患者的生存期[2]。在功能上，Wnt蛋白可參與腫瘤的發生和胚胎的發育，包括細胞命運和細胞結構[3-4]。低密度脂蛋白受體相關蛋白6（low density lipoprotein receptor related protein 6，LRP6）是LRP超家族成員之一，Wnt的共受體在Wnt信號轉導過程中發揮著主要的作用[5-6]。LRP6蛋白可與Frizzled家族成員結合，導致Wnt信號通路被激活，進而導致β-catenin的穩定性和核易位增強，而LRP6的異常表達可影響Wnt配體與LRP和Frizzled家族成員結合，進而影響受體活化以及腫瘤的進展、惡化[2]。采用抑制劑阻斷Wnt配體與LRP6中的Wnt結構域結合，可導致Wnt信號通路及其下游基因被抑制[7]。有研究發現，在小雞和斑馬魚中，Wnt1的異常表達可通過Lmx1b、Pax2和En2途徑調控FGF8的表達[8-9]，而FGF8可促進結直腸癌細胞的增殖，提高細胞的克隆形成能力，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移[10]。因此，在本研究中，猜測LRP6作為一種癌蛋白，其可能通過調節FGF8信號促進肺癌細胞的增殖。為了進一步揭示LRP6在肺癌發生、發展中的分子機制，首先利用Western blot法檢測了其在肺癌細胞系中的表達；然后，通過在細胞中沉默LRP6表達檢測其對細胞增殖和克隆形成能力的影響；最后，研究其是否通過FGF8信號來發揮癌基因的作用。本研究將闡明LRP6在肺癌發生、發展中的作用機制，為臨床將LRP6與FGF8作為診斷、治療肺癌的靶標奠定研究基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞

正常肺細胞CCD-19Lu和肺癌細胞A549、H1299、SPCA-1、L78、PCL3、H460均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑與儀器

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、MEM培養基、RPMⅠ-1640培養基均購自美國Hyclone公司；siRNA（small interfering RNA，siRNA）-LRP6和siRNA-control由上海GenePharma公司合成；Lipofectamine 2000轉染試劑、Trizol試劑均購自美國Ⅰnvitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒均購自大連Takara公司；7300實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）系統購自美國Applied Biosystems公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）購自美國Sigma公司；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RⅠPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；抗 LRP6（ab118490）、FGF8（ab89550）、β-actin（ab8245）均購自美國Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 正常肺細胞CCD-19Lu采用含10%FBS的MEM培養基培養，肺癌細胞A549、H1299、SPCA-1、L78、PCL3、H460采用含10%FBS的RPMⅠ-1640培養基培養。所有細胞均在含5%CO2的細胞培養箱中于37℃下培養。

1.3.2 細胞轉染 通過檢測發現，LRP6在肺癌細胞A549中的相對表達量最高，因此后續研究將A549作為研究對象。將siRNA-LRP6和siRNA-control按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書轉染至A549細胞中，分別記為siRNA-LRP6組和siRNA-control組。siRNA-LRP6序列：5'-CCG CAT GGT GAT TGA TGA A-3'；siRNA-control序列：5'-UUC UCC GAA CGU GUC CGG A-3'。

1.3.3 qRT-PCR檢測 采用Trizol試劑從培養的細胞中提取總RNA，并根據說明書使用Prime-Script RT試劑盒進行逆轉錄。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒在7300實時熒光定量PCR分析系統上進行qRT-PCR。LRP6 PCR擴增引物：上游5'-GAG CTG GAC TGT TAT CCA ACT G-3'和下游5'-CTT CAT ACG AGG ACA CAG CAT C-3'；β-actin引物：上游5'-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3'和下游5'-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3'。實驗至少重復3次。以LRP6/β-actin計算LRP6的相對表達量。

1.3.4 細胞增殖能力檢測 MTT實驗和克隆形成實驗按照先前研究報道的方案進行[11]。將siRNA-LRP6或siRNA-control轉染至A549細胞中，于24、48、72 h時分別加入MTT進行測定，在波長490 nm處采用酶標儀測定各組光密度（optical density，OD）值?？寺⌒纬蓽y定按照以下步驟進行：轉染48 h后，取500個A549細胞接種于6孔板中，培養10～14 d后，采用結晶紫染色，計數斑點。實驗至少重復3次。

1.3.5 蛋白質印跡法（Western blot）檢測 按照先前報道所述的方法進行Western blot檢測[13]，收集細胞，RⅠPA裂解液裂解，離心取上清，BCA法測定蛋白含量，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白并轉膜，將膜與抗體（LRP6、FGF8、β-actin）進行室溫孵育2 h，最后曝光顯影。實驗至少重復3次。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對-數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LRP 6在肺癌細胞系中的表達情況

LRP6在肺癌細胞L78、A549、H1299、SPCA-1、PCL3和H460中的表達水平均明顯高于LRP6在正常肺細胞CCD-19Lu中的表達水平，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 LRP 6蛋白在肺癌細胞系中的相對表達量（±s）

表1 LRP 6蛋白在肺癌細胞系中的相對表達量（±s）

細胞CCD-19Lu L78 A549 H1299 SPCA-1 PCL3 H460 LRP6蛋白相對表達量0.22±0.04 0.87±0.07 1.21±0.06 1.02±0.09 1.19±0.09 0.57±0.03 0.78±0.08

2.2 siRNA沉默LRP 6表達

轉染siRNA-LRP6后，A549細胞中LRP6mRNA和LRP6蛋白的相對表達量分別為（0.22±0.04）和（0.14±0.01），均明顯低于siRNA-control組的（0.94±0.07）和（0.39±0.03），差異均有統計學意義（t=15.468、13.693，P＜0.01）。（圖1）

2.3 沉默LRP 6對細胞增殖的影響

轉染siRNA-LRP6后，細胞在 24、48、72 h的OD值均低于siRNA-control組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 沉默LRP 6后不同時間點 A549細胞OD值的比較（ n= 3，±s）

表2 沉默LRP 6后不同時間點 A549細胞OD值的比較（ n= 3，±s）

組別siRNA-control組siRNA-LRP6組t值P值24 h 0.58±0.04 0.41±0.03 7.141 0.002 48 h 1.08±0.16 0.78±0.09 2.831 0.047 72 h 1.63±0.21 0.93±0.11 5.114 0.007

2.4 沉默LRP 6對細胞克隆形成能力的影響

結晶紫染色后發現，siRNA-LRP6組細胞的克隆形成數目為（56±13）個，低于siRNA-control組的（119±24）個，差異有統計學意義（t=3.998，P=0.016）。

2.5 沉默LRP 6對FGF 8信號的影響

Western blot法檢測結果顯示，siRNA-LRP6組A549細胞中FGF8及增殖相關蛋白Cyclin D1、LRP6的表達水平均明顯低于siRNA-control組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3）

表3 A549細胞中FGF 8、Cyclin D 1及LRP 6蛋白相對表達量的比較（ n= 3，±s）

表3 A549細胞中FGF 8、Cyclin D 1及LRP 6蛋白相對表達量的比較（ n= 3，±s）

組別siRNA-control組siRNA-LRP6組t值P值FGF8 1.12±0.13 0.33±0.06 9.557 0.001 Cyclin D1 2.64±0.21 1.02±0.12 11.601 0.000 LRP6 1.86±0.22 0.26±0.03 12.481 0.000

3 討論

肺癌是世界上發病率及病死率最高的惡性腫瘤之一，主要包括兩種類型，分別是小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[12]。SCLC占所有肺癌的15%～20%，其更具侵略性，通常在早期已經發生轉移[13]；而NSCLC占所有肺癌的80%～85%，并可進一步分為腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌和各種混合型癌，大多數NSCLC患者被診斷時已經處于晚期，僅有約11個月的中位生存期[14-15]。

越來越多的證據表明，Wnt途徑是維持肺動態平衡的主要信號途徑之一，其異常激活可能與多種衰弱性肺疾病有關[12]。類似于其他惡性腫瘤，Wnt信號在肺癌的發生中發揮著重要的作用。以往研究表明，LRP6參與了腫瘤細胞的調控，在口腔癌中，LRP6是一個潛在的預測靶標[10]。此外，LRP6也可通過改變β-catenin亞細胞的分布來促進人纖維肉瘤HT1080細胞的增殖[16]。有研究已證實，LRP6是Wnt/β-catenin信號通路的重要共激活因子，LRP6可與Wnt配體結合，進而促進Wnt/β-catenin信號轉導[17-18]，其機制是LRP6可募集axin至細胞膜上，進而增加β-catenin的穩定性，并促進其核易位，通過與LEF-1/TCF轉錄因子作用，從而促進Wnt/β-catenin通路下游基因轉錄[19]。有研究顯示，臨床樣本中，FGF8高表達與腫瘤的進展有關，并預示著某些惡性腫瘤（包括前列腺癌和乳腺癌）預后較差[12]。LRP6是Wnt/β-catenin通路的重要共激活因子，而Wnt/β-catenin 通路又可調節 FGF8的表達[10]，猜測在肺癌中，LRP6也可能通過FGF8信號促進腫瘤的發生、發展。

在口腔癌細胞中，LRP6是Wnt/β-catenin通路的重要共激活因子，而Wnt/β-catenin通路也可調控FGF8的表達，FGF8是Wnt通路的下游基因[10]。研究發現，FGF8在正常成人組織中表達較低，但在胚胎發育期間及包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌在內的幾種激素惡性腫瘤中廣泛表達，FGF8可在胚胎發育過程中介導胚胎上皮細胞向間質細胞方向轉化，進而參與原腸胚形成、早期分化和腦、四肢和腎臟的形成[20-21]。在細胞培養和轉基因動物模型中，FGF8能夠促進乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌腫瘤的發生，其可通過自分泌和旁分泌循環促進腫瘤的生長和血管的生成，賦予多種腫瘤細胞惡性表型[22]。FGF-8可以增強體外前列腺癌細胞的侵襲和遷移能力，并促進體內骨轉移[23]；在小鼠乳腺腫瘤細胞中，過表達FGF8可誘導細胞上皮間質轉化（epithelial interstitial transformation，EMT）和貼壁自主生長，并加速體內腫瘤的生長[24]。然而，FGF8在肺癌中的作用機制仍未完全闡明，猜測在肺癌中，LRP6也可能通過FGF8信號發揮促進腫瘤發生、發展的作用。

本研究發現，LRP6在正常肺細胞CCD-19Lu中呈低表達，而在肺癌細胞株中普遍呈高表達；且沉默LRP6可明顯抑制腫瘤細胞的增殖和克隆形成能力，作用機制可能與FGF8信號及其下游增殖相關蛋白的表達有關。本研究首次報道了LRP6通過調節FGF8信號對肺癌細胞增殖的影響，LRP6可能是診斷治療肺癌的潛在分子靶標。

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