miRNA-145、Ki-67、survivin、Aurora-b在喉鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

楊酉，谷曼麗

1北京怡德醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，北京100097

2北京市優聯耳鼻喉科醫院鼻咽喉-頭頸外科，北京100122

喉癌是一種常見的耳鼻咽喉科惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的近8%，發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是喉癌的主要病理類型，具有病死率高、預后差等特點。目前的研究認為，飲酒、吸煙等外界因素及遺傳因素共同作用導致了喉癌的發生和發展。喉癌的發生和發展是一個多種基因參與、多個階段相互作用的過程，因此基因的研究也逐漸成為喉癌病因學研究的重點[3-4]。miRNA-145是一種新發現的高度保守的miRNA，在各種腫瘤組織中低表達，且與腫瘤的預后密切相關[5]。Ki-67是一種與細胞有絲分裂密切相關的核蛋白，在各種腫瘤組織中高表達[6]。survivin是一種目前已知的最強的凋亡抑制蛋白，在正常分化的組織中幾乎不表達，而在腫瘤組織中高表達[7]。Aurora-b是一種與細胞有絲分裂密切相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種腫瘤組織中高表達[8]。目前，miRNA-145、Ki-67、survivin、Aurora-b與喉癌發生和發展關系的研究報道尚不多見。本研究探討miRNA-145、Ki-67、survivin、Aurora-b在LSCC中的表達情況，并分析其與患者臨床特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年12月至2017年6月于北京市優聯耳鼻喉科醫院接受全喉和部分喉切除術并經病理證實的85例LSCC患者的組織標本。85例患者中，男62例，女23例；年齡45～72歲，中位年齡55.8歲，≤60歲49例，＞60歲36例；高分化16例，中分化37例，低分化32例；腫瘤直徑：≤2 cm 50例，＞2 cm 35例；TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期28例，Ⅲ期19例，Ⅳ期8例；有淋巴結轉移33例，無淋巴結轉移52例。另選取85例癌旁正常組織（距癌組織＞10 mm）標本作為對照。所有患者均有完整的臨床資料，術前均未接受過任何化療、放療及生物治療。

1.2 主要試劑

Trizol試劑盒、第一鏈cDNA反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR（Real-Time PCR，RT-PCR）試劑盒均購自美國Ⅰnvitrogen公司；兔抗人Ki-67、survivin、Aurora-b多克隆抗體均購自美國Abcam公司。

1.3 RT-PCR檢測LSCC組織及癌旁正常組織中miRNA-145的表達

根據Trizol試劑盒說明書提取組織中總RNA，利用微量紫外分光光度計檢測并確定RNA濃度及純度。根據第一鏈cDNA反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，然后采用RT-PCR試劑盒將逆轉錄產物進行擴增，反應體系（20 μl）：cDNA 2 μl，上游引物（10 μmol/L）0.4 μl，下游引物（10 μmol/L）0.4 μl，SYBR Green solution 10 μl，滅菌雙蒸水7.2 μl。反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，60 ℃、1 min，共40個循環。miRNA-145上游引物：5'-ATCGTCCAGTTTTCCCAGG-3'，下游引物：5'-CGCCTCCACACACTCACC-3'。內參U6上游引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下 游 引 物 ：5'-CGAACGCTTACGAATTTG-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 分 析miRNA-145的表達量，其中△△Ct=（待測組目的基因Ct值－待測組內參基因Ct值）－（對照組目的基因Ct值－對照組內參基因Ct值）。

1.4 免疫組化法檢測Ki-67、survivin、Aurora-b的表達

石蠟標本包埋，于二甲苯、梯度酒精中脫蠟水化，3%的過氧化氫滅活30 min后，置于枸櫞酸鹽緩沖液中，于微波爐中熱修復10 min。兔抗人Ki-67、survivin、Aurora-b多克隆抗體4℃孵育過夜，加入相應二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染、梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。選取磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.5 結果判斷

在顯微鏡下觀察，Ki-67、survivin蛋白主要表達于細胞質中，若出現棕黃色或棕褐色顆粒，則為陽性表達；Aurora-b蛋白主要表達于細胞核中，若出現棕褐色顆粒，則為陽性表達。在400倍顯微鏡下隨機觀察1張組織切片中的5個視野，采用雙盲法對染色結果進行評估。根據染色程度評分：未著色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。根據陽性細胞占視野中細胞總數的百分比進行評分：未發現陽性細胞記為0分，1%～10%記為1分，11%～50%記為2分，51%～80%記為3分，≥81%記為4分。每張切片的最后得分為兩次評分的乘積：0分為陰性（－），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9分及以上為強陽性（+++）。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對-數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法及χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LSCC組織及癌旁正常組織中miRNA-145表達量的比較

LSCC組織中miRNA-145的表達量為（0.72±0.10），明顯低于癌旁正常組織的（2.18±0.44），差異有統計學意義（t=29.831，P＜0.01）。以0.72為界限，將85例LSCC組織進行分組，表達量≥0.72為陽性表達，表達量＜0.72為陰性表達，其中51例陰性表達，34例陽性表達。

2.2 miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達率的比較

LSCC組織中miRNA-145的陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，Ki-67、survivin、Aurora-b的陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

2.3 miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b的陽性表達率與LSCC患者臨床特征的關系

不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度LSCC患者的miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。Ⅲ～Ⅳ期LSCC患者的miRNA-145陽性表達率明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結轉移LSCC患者的miRNA-145陽性表達率明顯低于無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。Ⅲ～Ⅳ期LSCC患者的Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達率均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結轉移LSCC患者的Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達率均明顯高于無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表1 LSCC組織和癌旁正常組織中miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達情況比較[ n（%）]

2.4 LSCC組織中miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b表達的相關性

經Pearson相關性分析，LSCC組織中miRNA-145與Ki-67、survivin、Aurora-b的表達均呈負相關（r=-0.624、-0.862、-0.571，P＜0.01），Ki-67與 survivin的表達呈正相關（r=0.893，P＜0.01），Ki-67與Aurora-b的表達呈正相關（r=0.576，P＜0.01），survivin與Aurora-b的表達呈正相關（r=0.884，P＜0.01）。

3 討論

喉癌的發生和發展是一個多種基因參與、多個階段相互作用的過程，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡蛋白及抑凋亡蛋白的異常表達[3-4]。miRNA是一類長度約為20 nt高度保守的能夠與靶基因結合的小分子RNA，通過調控靶基因轉錄，參與細胞的生命歷程。miRNA-145的基因位于染色體5q32位點，被認為是一種抑癌miRNA，在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中低表達，但在LSCC中的表達水平報道較少[5]。本研究通過RT-PCR檢測85例LSCC組織及85例癌旁正常組織中miRNA-145的表達量，結果與張定富等[9]的研究報道一致：LSCC組織中miRNA-145的表達量明顯低于癌旁正常組織，提示miRNA-145在LSCC的發生過程中起抑癌作用。本研究還發現，miRNA-145的陽性表達率與LSCC患者的TNM分期和淋巴結轉移情況有關（P＜0.01），而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度無關（P＞0.05），說明miRNA-145表達水平的高低提示著LSCC的浸潤轉移程度。

Ki-67基因是1980年從兔血清中發現的一種與細胞有絲分裂密切相關的核蛋白，在細胞周期的G1期開始表達并于M期達到峰值[6]。Ki-67能夠在一定程度上反映細胞的增殖程度，與腫瘤的發生和發展密切相關。本研究結果顯示，LSCC組織中Ki-67的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，與Gioacchini等[10]和楊光等[11]的研究結果一致，說明Ki-67在喉癌的發生和發展過程中起著促進作用。本研究還發現，Ki-67的陽性表達率與LSCC患者的TNM分期和淋巴結轉移情況有關（P＜0.01），而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度無關（P＞0.05），與楊光等[11]的研究結果類似，提示Ki-67高表達可能促進LSCC細胞的惡性增殖，加速LSCC細胞的浸潤轉移。

survivin基因是1997年發現的一種位于染色體17q25的凋亡抑制基因，其表達產物是目前發現的最強的凋亡抑制蛋白，除了胚胎組織外幾乎不表達于任何正常分化的組織，但在肝癌、肺癌、宮頸癌、子宮癌等多數腫瘤組織中高表達，并與患者的預后密切相關[7]。本研究結果顯示，LSCC組織中survivin的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，與Marioni等[12]的研究結果一致。本研究還發現，survivin的陽性表達率與LSCC患者的TNM分期和淋巴結轉移情況有關（P＜0.01），而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度無關（P＞0.05），與楊光等[11]的研究結果類似，提示survivin可能通過調控細胞周期進程，促進LSCC細胞的惡性轉化，并加速LSCC細胞的浸潤轉移。

表2 miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b的陽性表達率與LSCC患者臨床特征的關系

Aurora是1998年發現的一種與細胞有絲分裂密切相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括Aurora-a、Aurora-b、Aurora-c三個成員，其中Aurora-a和Aurora-b對有絲分裂過程中中心體成熟、染色體分離具有明顯的調控作用。Aurora-b能夠與survivin、內著絲粒蛋白、Borealin形成染色體過客復合物，調控染色體的結構與功能。研究顯示，Aurora-b在多種腫瘤組織中高表達，且以Aurora-b為靶點設計的腫瘤抑制劑也逐漸受到關注[8]。García-Fernández等[13]和胡慈浩等[14]的研究顯示，Aurora-b在LSCC組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，與本研究結果一致，說明高表達的Aurora-b與LSCC的發生密切相關。本研究還發現，Aurora-b與LSCC患者的TNM分期和淋巴結轉移情況有關（P＜0.01），而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度無關（P＞0.05），提示Aurora-b高表達可能加速了癌細胞有絲分裂的進程，進而加快了癌細胞的增殖速度，最終促進癌細胞的浸潤轉移。因此，以Aurora-b作為靶點設計腫瘤小分子抑制劑無需考慮LSCC患者的年齡、性別等臨床特征。

研究顯示，Ki-67與細胞周期進程密切相關，Aurora-b能夠參與細胞的有絲分裂過程，survivin不僅能夠與Aurora-b形成復合物參與細胞的有絲分裂，還能參與細胞周期的調控過程[6-8]。另有研究顯示，喉癌組織中survivin與Ki-67的表達呈正相關，survivin與Aurora-b的表達呈正相關[11,15]。本研究結果顯示，LSCC組織中Ki-67、survivin及Aurora-b的表達兩兩之間呈正相關。提示Ki-67、survivin、Aurora-b可能通過調控細胞周期進程參與喉癌的發生和發展，可能成為喉癌診斷的潛在指標。本研究還發現，LSCC組織中miRNA-145與Ki-67、survivin、Aurora-b的表達均呈負相關，說明miRNA-145作為喉癌的治療靶點，Ki-67與survivin可能是其下游的靶基因之一，但具體機制有待于進一步研究。

綜上所述，miRNA-145在LSCC組織中低表達，Ki-67、survivin、Aurora-b在LSCC組織中高表達，miRNA-145、Ki-67、survivin、Aurora-b的陽性表達率與LSCC患者的TNM分期和淋巴結轉移情況密切相關，四者聯合檢測可能成為LSCC診斷的有效指標。

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